一种高效扩增cik的方法

文档序号:9367614阅读:502来源:国知局
一种高效扩增cik的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞治疗领域,尤其是涉及一种高效扩增CIK的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来,肿瘤的发生率和死亡率在我国逐年上升,据《2012年中国肿瘤登记年报》 显示,我国每年新发癌症病例约350万,因癌症死亡人数约250万,全国每天有8550人成为 癌症患者,且癌症发病成年轻化趋势。过继性免疫细胞治疗是一种肿瘤康复医学中新兴的、 具有显著疗效的全新抗肿瘤治疗方法,是继手术、放疗、化疗三大传统治疗方法后的另一种 治疗手段,最大的优势在于它的个体性、安全性、靶向性和高效性。
[0003] 细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKillercells,CIK)属于免疫细胞 治疗的一种,最早是由美国斯坦福大学生物学专家于1991年首次报道,他们发现在多种细 胞因子(IFN-y、CD3单克隆抗体、IL-I和IL-2)作用下,外周血淋巴细胞可以被定向诱导并 大量增殖成为肿瘤杀伤细胞。由于该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子,因此 具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞的非MHC限制性杀瘤的优点。CIK细胞具 有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前 体细胞细胞毒性小等特点,是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强,适合临床应用的一种理想 的效应细胞,但这种效应细胞在正常外周血中极其少见,仅为1 %~5%。由此可见,就免疫 细胞治疗来说,如何获得足够数量的、免疫活性强的效应细胞是保证治疗效果的必备条件。
[0004] CIK细胞能通过体外诱导而大量增殖,常规的CIK制备方法是将分离的外周血单 个核细胞加入培养液中,通过添加⑶3单克隆抗体(⑶3mAb)、IFN-y、IL-2等相关细胞生长 因子进行刺激诱导,最终获得一定数量的CIK细胞,但最终获得的CIK细胞的细胞毒活性和 增殖倍数都不够理想。上述细胞生长因子中,⑶3mAb促进CIK细胞中T细胞活化和增殖, IFN-y具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用,因此会增强T细胞对IL-2促增殖 反应的敏感度和强度;IL-2通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T 细胞活化,并进入细胞分裂状态。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的旨在针对现有方法所得CIK细胞存在增殖倍数低、⑶3+⑶56+双阳 表达率不高等问题,提供一种高效扩增CIK的方法,可明显提高CIK细胞增殖倍数和细胞毒 活性,扩增细胞倍数达1000倍以上,⑶3+⑶56+双阳表达率大于30%。
[0006] 为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:一种高效扩增CIK的方法,无 菌采集健康人或患者外周血,生理盐水等体积稀释后,用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个 核细胞,在CIK细胞诱导过程中,加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-y、IL-2、IL-Ia,培养13-16 天收获细胞,制备CIK细胞制剂。
[0007] 具体说,包括以下步骤:
[0008] (1)采集正常健康人或肿瘤患者外周血,经检测无污染后,等体积生理盐水稀释, 利用Ficoll淋巴细胞分离液将稀释外周血进行单个核细胞分离;分离得到的PBMC用无血 清培养基调整浓度至5XIO5个/ml-9X10 5个/ml,制成PBMC细胞悬液;
[0009] (2)将步骤⑴的PBMC细胞悬液转移至T-175培养瓶中,总体积100ml,并添加 CD3mAb、CD28mAb、IL-2 ;
[0010] (3)转天向培养体系中加入IFN-y和IL-Ia,计为培养的第1天;
[0011] (4)培养第3天,细胞计数,补加IL-2,使IL-2终浓度与步骤⑵时的浓度一样;
[0012] (5)培养第5天,细胞计数,加入100mL淋巴细胞完全培养基,补加IL-2,使IL-2 终浓度与步骤(2)时的浓度一样;
[0013] (6)培养第7天,补加与原培养体系等体积的无血清培养基、⑶3mAb、⑶28mAb、 IL-2,使⑶3mAb、⑶28mAb、IL-2终浓度与步骤(2)时的浓度一样;
[0014] (7)每隔2天进行细胞计数并补加与原培养体系等体积的无血清培养基,并补加 IL-2,使IL-2终浓度与步骤(2)时的浓度一样,连续培养13-16天后,离心收获CIK细胞。
[0015] 所述Ficoll淋巴细胞分离液密度为I. 077g/ml。
[0016] 所述步骤⑵和步骤(6)中,⑶3mAb量在培养体系中终浓度为l-29ng/ml、 CD28mAb终浓度为 50-99ng/ml。
[0017] 所述步骤(3)中,添加入培养体系中IFN-y的终浓度为701-999IU/ml。
[0018] 所述步骤(3)中,添加入培养体系中IL-Ia的终浓度为51-99yg/ml。
[0019] 所述添加入培养体系中IL-2的终浓度为500-999IU/ml。
[0020] 所述培养第7天开始将细胞培养液转移至培养袋中进行扩大培养。
[0021] 本发明的有益效果是:在CIK细胞诱导过程中,加入⑶3单克隆抗体(⑶3mAb)、 CD28 单克隆抗体(CD28mAb)、干扰素-y(IFN-y)、白介素-2 (IL-2)、白介素Ia(IL-1a), 培养13-16天收获细胞,制备CIK细胞制剂,并进行流式细胞学检测和微生物学检测。本 发明提供的CIK培养方法可以在两周的时间内将CIK数量提高到6XIO9以上、细胞成活率 99%以上,其中⑶3+⑶56+细胞的双阳性比例达到30%以上。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例1中CIK细胞体外增殖曲线。
[0023] 图2为本发明实施例1中CIK细胞对肿瘤细胞(人宫颈癌HeLa细胞系)的体外 杀伤率。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明:
[0025] 本发明的高效扩增CIK的方法,无菌采集健康人或患者外周血,生理盐水等体积 稀释后,用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞,在CIK细胞诱导过程中,加入⑶3mAb、 CD28mAb、IFN-y、IL-2、IL-Ia,培养13-16天收获细胞,制备CIK细胞制剂。
[0026] 具体说,包括以下步骤:
[0027] (1)采集正常健康人或肿瘤患者外周血,经检测无污染后,等体积生理盐水稀释, 利用Ficoll淋巴细胞分离液将稀释外周血进行单个核细胞分离;分离得到的PBMC用无血 清培养基调整浓度至5XIO5个/ml-9X10 5个/ml,制成PBMC细胞悬液;
[0028] (2)将步骤⑴的PBMC细胞悬液转移至T-175培养瓶中,总体积100ml,并添加 CD3mAb、CD28mAb、IL-2;
[0029](3)转天向培养体系中加入IFN-y和IL-I a,计为培养的第1天;
[0030] (4)培养第3天,细胞计数,补加IL-2,使IL-2终浓度与步骤(2)时的浓度一样;
[0031] (5)培养第5天,细胞计数,加入100mL淋巴细胞完全培养基,补加IL-2,使IL-2 终浓度与步骤(2)时的浓度一样;
[0032] (6)培养第7天,补加与原培养体系等体积的无血清培养基、⑶3mAb、⑶28mAb、 IL-2,使⑶3mAb、⑶28mAb、IL-2终浓度与步骤(2)时的浓度一样;
[0033] (7)每隔2天进行细胞计数并补加与原培养体系等体积的无血清培养基,并补加 IL-2,使IL-2终浓度与步骤(2)时的浓度一样,连续培养13-16天后,离心收获CIK细胞。
[0034] 所述Ficoll淋巴细胞分离液密度为I. 077g/ml。
[0035] 所述步骤⑵和步骤(6)中,⑶3mAb量在培养体系中终浓度为l-29ng/ml、 CD28mAb终浓度为 50-99ng/ml。
[0036] 所述步骤(3)中,添加入培养体系中IFN-y的终浓度为701-999IU/ml。
[0037] 所述步骤⑶中,添加入培养体系中IL-Ia的终浓度为51-99yg/ml。
[0038] 所述添加入培养体系中IL-2的终浓度为500-999IU/ml。
[0039] 所述培养第7天开始将细胞培养液转移至培养袋中进行扩大培养。
[0040] 首先,本发明在具体实施过程中需要使用的试剂如下:
[0041] 表1主要试剂
[0042]
[0043] 实施例1
[0044] 无菌采集健康人或患者外周血100ml,2小时内运送到免疫细胞治疗室,在洁净车 间进行PBMC的分离和CIK的体外培养。全血经微生物免疫检测合格后方可进行后续分离 培养操作。
[0045] PBMC分离:
[0046] ?将外周血与生理盐水等体积混合,室温放置5分钟。
[0047] ?取200ul用血细胞计数仪计数。
[0048] ? 80mlFicoll离心分离PBMC。
[0049] ?离心参数:500g、19度、20分钟。
[0050]?取白膜。
[0051 ] ?加入生理盐水至总体积100mL,洗涤两次。
[0052] ?离心参数:300g、19度、5分钟。
[0053] 鲁使用移液管或者真空吸液栗移除上清液,不可倾倒。上清液余量在细胞沉淀上 0? 5_lcm处。
[0054] ?细胞重悬到IOml淋巴细胞完全培养基中。
[0055] ?利用细胞计数仪进行细胞计数。
[0056] ?计算细胞得率。
[0057] 实施例2
[0058] CIK诱导培养:
[0059] 鲁分离的PBMC计数后,按5XIO5个/ml密度接种。
[0060] ?将细胞加入CD3mAb(lOng/ml)、CD28mAb(50ng/ml)包被的T175 培养瓶中。
[0061] ?补充淋巴细胞完全培养基至100ml,加入IL-2(500IU/ml)。
[0062] ?转天向培养瓶中分别加入IFN-y(701IU/ml)、IL-Ia(51IU/ml)。
[0063] ?第 3 天,细胞计数,加入IL-2 (500IU/ml)。
[0064] ?第5天,细胞计数,加入100mL淋巴细胞完全培养基、IL-2 (500IU/ml)。
[0065] 鲁第7天,细胞计数,将细胞悬液移入细胞培养袋,加入200ml淋巴细胞完全培养 基、CD3mAb(lOng/ml)、CD28mAb(50ng/ml)、IL-2 (500IU/ml)。
[0066] ?每隔2天补加与原培养体系同等体积的淋巴细胞完全培养基和IL-2 (500IU/ ml) 〇
[0067] 鲁第13天和16天,细胞计数,收获细胞。
[0068] 备注:每种因子后面括号内数值表示各因子在培养体系中的终浓度。
[0069]CIK细胞体外增殖曲线:<
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