杂交瘤细胞株zjeb8-01、抗埃博拉病毒gp蛋白单克隆抗体及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及杂交瘤细胞株ZJEB8-01、抗埃博拉病毒GP蛋 白单克隆抗体及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起的致死性出血热。1976年，埃博拉病毒在 扎伊尔首次暴发，后陆续在中非地区小规模暴发，截止2013年，共造成2387人发病，死亡 1310例，病死率54. 9%。2014年埃博拉病毒再次爆发，席卷西非，并跨越大洲，美国、英国、 西班牙相继发生埃博拉病例。截止2015年5月27日，共有26969例病例，病死11135例， 病死率仍高达41. 3%。从埃博拉首次爆发至今，已经过去了将近40年，目前国际上仍然没 有特异的治疗手段和可供临床使用的疫苗。埃博拉病毒病已经成为国际性重大传染病，埃 博拉病毒的快速、有效诊断和治疗方法的探索对埃博拉病毒病的控制以及对人类的安全至 关重要。
[0003] 经典埃博拉病毒感染的诊断依赖定量PCR技术，但是在埃博拉疫源地，由于经济 条件落后，不是每个国家和地区都能负担相应仪器的费用，因而该诊断方法的适用范围有 限，不能适用于全部地区。因而开发一种快速、灵敏、廉价的埃博拉病毒检测的单克隆抗体 产品，就可以广泛运用于疫源地，能够更早更广泛地发现埃博拉感染，提早进行隔离治疗， 减少埃博拉病毒的扩散。
[0004] 埃博拉病毒病目前仍然没有特效的治疗方法。到目前为止没有找到一种特效的抗 埃博拉病毒药物。虽然国际上已经研制出三种抗体混合的药物ZMapp，但是治疗效果仍然有 限且不确切。如果该抗体在临床I期缺乏有效性和安全性，那么人们将面临再一次无药可 用的境地，甚至缺少了可备用的药物。因而埃博拉单克隆抗体的继续开发，为埃博拉病毒病 治疗提供更多的备选抗体，就能大大地增大治疗埃博拉病毒病的可能性。
[0005] 综上所述，发展一种快速、灵敏的埃博拉病毒诊断抗体及发展一种有望用于临床 治疗的埃博拉抗体迫在眉睫。
【发明内容】
[0006] 本发明第一个目的是提供杂交瘤细胞株ZJEB8-01，该杂交瘤细胞株已由中国典 型培养物保藏中心（CCTCC)保藏;地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2015年6月3日； 保藏编号为：CCTCCNO:C201583。其具有序列表中SEQIDNO: 1所示的抗埃博拉病毒GP蛋 白单克隆抗体重链编码基因序列（其中，1-57为前导区，58-147为框架区1，148-162为互 补决定区1，163-204为框架区2, 205-255为互补决定区2, 256-351为框架区3, 352-366为 互补决定区3, 367-399为框架区4)和序列表中SEQIDNO: 2所示的抗埃博拉病毒GP蛋白 单克隆抗体轻链编码基因序列（其中，1-60为前导区，61-129为框架区1，130-177为互补 决定区1，178-222为框架区2, 223-243为互补决定区2, 244-339为框架区3, 340-366为互 补决定区3, 367-396为框架区4)。
[0007] 本发明第二个目的是提供一种抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体，它是由保藏编 号为：CCTCCNO:C201583的杂交瘤细胞株ZJEB8-01分泌。其重链氨基酸序列如序列表中 SEQIDN0:3所示，轻链氨基酸序列如序列表中SEQIDN0:4所示。该单克隆抗体亚型为 IgGUK型，与埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽具有高的特异性和灵敏性，所述抗原肽为埃博 拉病毒GP蛋白的第 412-431 位氨基酸序列，如SEQIDN0:5**:DNDSTASDTPPATTAAGPLK。
[0008] 本发明第三个目的是提供上述抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体的制备方法，包 括如下步骤：
[0009] ⑴小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽（埃博 拉病毒GP蛋白的第412-431氨基酸序列：DNDSTASDTPPATTAAGPLK)对小鼠进行免疫；每只 小鼠以IOOug的抗原肽混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次；第3次 加强免疫3天后用于融合；
[0010] (2)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好 的生长状态用于杂交瘤细胞融合；
[0011] ⑶细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养 细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20%FCS的HAT培 养基培养一天，将步骤（1)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞；收集步骤（2)中的小鼠 骨髓瘤细胞SP2/0,将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细 胞适当稀释，接种至饲养细胞培养板，适当条件培养；
[0012] (4)杂交瘤细胞的筛选：培养上述培养物，在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞 培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆；
[0013] (5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定 密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长；形成细胞集落的孔取培养 上清液做酶联免疫吸附检测（ELISA)，筛选和鉴定阳性克隆；重复克隆若干次，直到杂交瘤 细胞的阳性孔率达到100% ;
[0014] (6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只 0. 5ml，然后每只接种生长良好的5XIO6个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗 体效价；
[0015] (7)单克隆抗体的纯化：利用ProteinG亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。
[0016] 经单克隆抗体免疫球蛋白亚型分析显示该杂交瘤细胞产生的抗体类型为IgGUK 型。
[0017] 本发明第四个目的是提供杂交瘤细胞株ZJEB8-01在产抗埃博拉病毒GP蛋白单克 隆抗体中的应用。本发明由免疫的BALB/C小鼠脾脏淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融 合、筛选、克隆后获得的产生抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株ZJEB8-01， 经3次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗 体分泌未见衰退。ELISA间接法测得ZJEB8-01培养上清效价为1:320,腹水效价为1:25600。 ZJEB8-01已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC)保藏，保藏号是：CCTCCNo.C201583。
[0018] 本发明第五个目的是提供上述抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体在制备埃博拉病 毒GP蛋白检测试剂中的应用，该检测试剂在装载埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培养液 中或其它产生埃博拉病毒GP蛋白的体液或培养液中检测，通过下述途径实现：
[0019] ①以抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体为探针，用SDS-PAGE电泳通过免疫印迹方 法（WesternBlot)，对装载埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培养液中GP蛋白的情况进行 鉴定。
[0020] ②以抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体作为检测抗体，通过酶联免疫吸附试验 (ELISA)对装载埃博拉病毒GP蛋白的埃博拉疫苗培养液中GP蛋白表达水平进行定性和定 量分析。
[0021] 本发明的有益效果：
[0022] 1、本发明杂交瘤细胞株ZJEB8-01，经3次克隆化，持续培养六月余，分泌抗埃博拉 病毒GP蛋白单克隆抗体稳定；该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退。
[0023] 2、本发明抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体与埃博拉病毒GP蛋白的抗原肽具有高 的特异性和灵敏性，可用于制备对临床和实验室的埃博拉培养物进行定性和定量检测的检 测试剂，检测结果为临床提供实验室诊断依据。本发明还完成了对单克隆抗体的测序，为单 克隆抗体序列的人源化改造，研发具有中和埃博拉病毒的中和抗体，为后期发展成为临床 治疗埃博拉病毒病抗体奠定物质基础。
[0024] 保藏信息
[0025] 保藏的培养物名称：杂交瘤细胞株ZJEB8-01;
[0026] 保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；
[0027] 保藏单位简称：CCTCC;
[0028] 保藏地址：中国武汉武汉大学；
[0029] 保藏日期：2015年6月3日；
[0030]保藏