一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

文档序号:9367625阅读:415来源:国知局
一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用,属于食品安全免疫学 检测领域。
【背景技术】
[0002] 苯噻氰(TCMTB)是一种十分经济、有效的绿色杀菌剂,它与美国Buckmam公司的 BUSAN30L,法国Progiven公司的BIOCIDEMT30均属同一类产品,它能有效地应用于种子处 理,对存在的主要细菌、真菌和藻类都有极强的灭杀和控制作用,对于种子拌种、浸种和喷 雾治疗炭疽、稻瘟、猝倒、立枯和柑橘溃疡等病害有特效,因此,苯噻氰及其代谢产物在植物 与土壤都有较大的残留。
[0003] 目前检测苯噻氰的方法主要有气相色谱法(GC),液相色谱法(HPLC),分光光度 法、电化学测定法、气质联用法等方法。但是这些方法存在操作繁琐,耗时,费用比较贵等缺 点,不能实现大量样品的快速检测,因此建立一种快速简便的苯噻氰检测方法具有重要意 义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法,检测时对样本的纯度要 求不高而且操作简便,适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的 单克隆单体是免疫学检测的前提,其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株,由该细胞株制备的抗 体对苯噻氰具有较好特异性和检测灵敏度,可以用来建立苯噻氰的免疫学检测方法。
[0005] 本发明的技术方案,一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株,其命名为1B2,已保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo. 10862。
[0006] 所述苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2的制备,步骤为: 1) 完全抗原的合成: A液的制备:称取28. 6mgTCMTB类似物2-苯并噻唑硫代乙酸BTAC,EDC(碳二亚胺) 38. 3mg,NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)23.Omg,用ImL无水DMF溶解,称为A液,室温搅拌反应 8h; B液的制备:称取BSA(牛血清蛋白)112mg溶于20mLpH7. 4的0? 01mol/LPBS中,得 至IjB液; 在室温条件,逐滴将A液加入到B液中,室温反应过夜,得到偶联物BTAC-BSA混合液即 为苯噻氰完全抗原,通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原,并通过紫外吸收扫 描方法鉴定; 2) 小鼠的免疫: 苯噻氰完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后,通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第 一次免疫用完全弗氏佐剂,之后都用不完全弗氏佐剂;首免与加强免之间间隔一个月,加 强免3次,加强免之间间隔21天;最后用苯噻氰完全抗原,不含佐剂,冲击免疫;通过间接 ELISA检测血清效价和抑制; 3) 细胞融合与细胞株建立: 通过聚乙二醇PEG4000法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合,通过HAT培养基培 养,利用间接ELISA检测阳性细胞孔,并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑 制效果,通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆,最终筛选获得杂交 瘤细胞株1B2; 4) 杂交瘤细胞株性质的鉴定:通过ELISA法测定灵敏度和特异性。
[0007] 通过苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2分泌产生苯噻氰单克隆抗体。
[0008] 将苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于 食品接触相关材料中苯噻氰的快速检测,具体步骤如下: (1) 包被:将包被原TCMTB-0VA用0. 05MpH9. 6碳酸盐缓冲液从2Pg/mL开始倍比稀 释,100ML/孔,37°C反应 2h; (2) 洗涤:将酶标板内溶液倾去,甩干,并用洗涤液洗涤3次,每次3min; (3) 封闭:拍干后,加入200ML/孔封闭液,37°C反应2h;洗涤后烘干备用; (4) 加样:将抗血清从1:1000开始倍比稀释,并加入到各稀释度的包被孔中,100ML/ 孔,37°C反应Ih;充分洗涤后,加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG,100ML/孔,37°C反应 Ih; (5) 显色:将酶标板取出,充分洗涤后,每孔加入100ML的TMB显色液,37°C避光反应 15min; (6) 终止和测定:每孔加入50ML2MH2SO4终止液以终止反应,然后用酶标仪测定各孔 的OD45。值; (7) 结果判读:以OD45。值大于或等于阴性对照孔的2. 1倍,即P/N彡2. 1,所对应的血 清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价; (8) 标准曲线:配置0,1,2, 5,10, 20, 50,IOOyg/L苯噻氰标准溶液,采用间接竞争 ELISA绘制标准曲线,其IC5。为7yg/L。
[0009] 溶液的配置如下: 碳酸盐缓冲液CBS:称取Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2. 93g,分别溶于少量双蒸水后混合,加 双蒸水至约800mL混匀,调pH值至9. 6,加双蒸水定容至lOOOmL,4°C贮存备用; 磷酸盐缓冲液PBS:8. 00gNaCl,0.2gKCl,0.2gKH2PO4, 2.9gNa2HPO4* 12H2O,溶 于800mL纯水中,用NaOH或HCl调pH到7. 2~7. 4,定容至1000 mL; PBST:含 0? 05% 吐温-20 的PBS; TMB显色液:A液:Na2HPO4 ? 12H20 18. 43g,柠檬酸 9. 33g,纯水定容至 1000mL;B液: 60mgTMB溶于IOOmL乙二醇中;A、B液按1 : 5体积比混合即为TMB显色液,现用现混。
[0010] 本发明的有益效果:本发明获得的抗苯噻氰单克隆抗体细胞株,对苯噻氰有较好 的检测灵敏度和特异性(IC5。值为7yg/L)。
[0011]生物材料样品保藏:一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2,已保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号 院3号中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCCNo. 10862,保藏日期2015年5月19 曰。
【附图说明】
[0012] 图1是1B2单克隆抗体的抑制标准曲线。
【具体实施方式】
[0013] 本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明,不能作为本发明的限定内 容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0014] 本发明通过将苯噻氰完全抗原免疫小鼠,通过细胞融合,HAT选择性培养基培养, 通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清,最终得到了对苯噻氰有较好特异性和灵 敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0015] 实施例1杂交瘤细胞株1B2的制备 (1) 完全抗原的合成 称取28. 6mgTCMTB类似物2-苯并噻唑硫代乙酸(BTAC),EDC(碳二亚胺)38. 3mg,NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)23.Omg,用ImL无水DMF溶解(称为A液),室温
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