一株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] -株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，涉及杂交瘤细胞株1D4及其产 生的利巴韦林单克隆抗体。本发明属于食品安全免疫学检测领域。
【背景技术】
[0002] 利巴韦林为抗病毒药物，是广谱强效的抗病毒药物，由于其毒副作用强，易引起免 疫系统损伤和致畸。早在2005年农业部就明确规定禁止利巴韦林等抗病毒兽药的销售和 使用。
[0003] 目前检测利巴韦林的主要方法有仪器检测方法和免疫检测方法。仪器检测方法虽 然检测准确，但仪器昂贵，操作复杂，样品前处理繁琐。免疫检测方法相对于仪器检测方法， 具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于，第一次提供一株对利巴韦林具有较好亲和力和检测灵敏度的单 克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。
[0005] 本发明提供一株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对利 巴韦林具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立利巴韦林总量的免疫学检测方法， 或利巴韦林免疫亲和柱的制备。
[0006] 本发明的技术方案：一株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为1D4,已保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 10864。
[0007] 利巴韦林单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCNo. 10864的利巴韦林单克隆 抗体杂交瘤细胞株1D4所分泌产生。
[0008] 所述的利巴韦林单克隆抗体的应用，用于食品安全中利巴韦林含量的检测。
[0009] 本发明提供的细胞株1D4的制备步骤为： (1) 免疫原的制备与鉴定：利巴韦林与丁二酸酐反应后，通过活化酯法与蛋白载体相 连，通过透析分离利巴韦林完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过蛋白质电泳方法鉴 定； (2) 小鼠的免疫：将利巴韦林完全抗原与福氏免疫佐剂?混合均匀后，通过背部皮下多 点注射免疫BALB/c小鼠。免疫过程总共五次：第一次将利巴韦林完全抗原与福氏完全佐剂 混合，后三次用利巴韦林完全抗原与福氏不完全佐剂免疫，最后一次用利巴韦林完全抗原 (不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制； (3) 细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤 细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争 ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三 次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株1D4; (4) 杂交瘤细胞株性质的鉴定：抗体亚型的鉴定采用小鼠单克隆抗体亚型试剂盒方法； IC5。值、亲和力的测定通过ELISA法。
[0010] 本发明的有益效果：（1)本发明第一次获得利巴韦林单克隆抗体细胞株，对利巴 韦林有较好的检测灵敏度和亲和力，（IC5。值为Ing/mL和亲和常数为8. 04X10 9L/mol); (2)通过制备新的抗体的思路，在于用两种或更多结构相似的半抗原的完全抗原，连续间隔 免疫，得到很好的通用型单克隆抗体细胞株。
[0011] 生物材料样品保藏：一株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株1D4,已保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.10864。保藏日期为2015年 5月19日。
【附图说明】
[0012] 图I1D4单克隆抗体对利巴韦林的标准曲线。
【具体实施方式】
[0013] 本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明，不能作为本发明的限定内 容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0014] 本发明通过将利巴韦林完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培 养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对利巴韦林具有较好亲和 力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
[0015] 实施例1 :杂交瘤细胞株1D4的制备 1、完全抗原的合成 利巴韦林l〇〇mg，溶解于5mL无水DMF和5mL无水吡啶混合溶液中，加入50mg琥珀酸 酐，60°C回流反应12h，并于pH约为3, (TC条件下静置重结晶，得到白色沉淀，离心烘干得利 巴韦林半抗原。取IOmg利巴韦林半抗原，加入2mL超纯水溶解，再分别加入NHS (N-羟基 琥珀酰亚胺)，H)C(碳二亚胺)，半抗原：NHS : EDC的摩尔比为1:2:2,室温下，混匀， 搅拌反应6h，再在室温25°C下反应12h进行活化。取25mg牛血清蛋白（BSA)，半抗原与牛 血清蛋白的摩尔比为80:1，加入5mL 0.1 M pH 9. 6碳酸盐缓冲液。将活化的利巴韦林半 抗原溶液慢速滴加到蛋白溶液中，室温下反应24h。用PBS缓冲液透析2天，期间换水4次， 即得到利巴韦林完全抗原。
[0016] 2、动物免疫 选择健康的6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取利巴韦林完全抗原（Img/mL)与等 量福氏免疫佐剂?混合均匀后，通过背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只200yL。第 一次免疫用利巴韦林完全抗原与福氏完全佐剂混合免疫，之后用利巴韦林完全抗原与福氏 不完全佐剂混合免疫，间隔时间均为21天；四免后10天采血，使用间接ELISA和间接竞争 ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在四免后15天冲击免疫，只使 用利巴韦林完全抗原、不使用佐剂，腹腔注射。
[0017] 3、细胞融合在冲击免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进 行细胞融合，具体步骤如下：（1)无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞 悬液，并进行细胞计数；（2 )收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计 数；（3)将脾细胞和SP2/0细胞按照I: 10的计数比例混合，离心后用50%PEG融合，时 间Imin，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、 2%的50XHAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37°C、5%CO2的培 养箱中培养。
[0018] 4、细胞筛选与细胞株建立在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选 培养液半换液，第6天进行用含20%胎牛血清、1%的100XHAT的RPMI-1640过渡培养液进 行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性 细胞孔，第二步选用利巴韦林标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选 择对利巴韦林标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进 行检测。重复二次，获得细胞株1D4。
[0019] 5、单克隆抗体的制备与鉴定 取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油ImL;7天后每只小鼠腹腔注射IXIO6杂交瘤细胞株1D4,从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得 的单抗置于-20°C保存。
[0020] 使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚 型鉴定，其亚型为IgGl型。
[0021] 使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对利巴韦林的IC5。为：lng/ mL，亲和常数为8. 04XIO9L/mol，说明对利巴韦林具有很好的灵敏度和亲和力，可用于利 巴韦林总量免疫分析检测和亲和柱的制备。
[0022] 6、抗体应用 将杂交瘤细胞株1D4通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于利巴韦林的ELISA添加回 收试验，具体步骤如下： (1) 用碳酸盐缓冲液（CBS)稀释好的I. 5yg/mLRBV-OVA作为包被原包被96孔酶标 板，每孔100yL，37°C包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250yL，每次3min，拍 干； (2) 用含0. 01%明胶的CBS进行封闭，每孔200yL，37°C封闭2h，用PBST洗液洗板三 次，每次每孔250yL，每次3min，拍干； (3) 磷酸盐缓冲液（PBS)分别配置0,0. 03,0. 1，0. 3,1，3,10,30ng/mL的利巴韦林标准 溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50yL， 每个样品重复3个孔，再每孔加入50iiL1 : 16000稀释的抗利巴韦林单克隆抗体，37°C反 应〇.5h后，洗板拍干； (4) 每孔加入100yL用含0.01%明胶的PBS1 : 3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，37 °C反应0. 5h后，洗板拍干； (5) 每孔加入IOOyLTMB显色液，37°C显色15min后，每孔加入50yL2MH2SO4终止 液，450nm测吸光值； (6) 添加回收及样品前处理：称取Ig鸡肉均质样品置入50mL离心管中，分别添加 0. 5ng、lng及5ng利巴韦林。向样品中加入IOmL含1%的三氯乙酸的乙腈溶液（w/v)震荡 均匀后，超声提取30min，离心，取上清液，氮气吹干后加入5mL正已烷，超声，离心，取上清 液，氮气吹干，加入ImLPBS溶解，作为ELISA样品提取液，采用间接竞争ELISA进行添加回 收试验，其回收率分别为72%，85%，93%。
[0023] 溶液的配置： 碳酸盐缓冲液（CBS):称取Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2. 93g，分别溶于少量双蒸水后混合， 加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9. 6,加双蒸水定容至1000mL，4°C贮存备用； 磷酸盐缓冲液（PBS):8. 00gNaCl，0.2gKCl，0.2gKH2PO4, 2.9gNa2HPO4.12H20,溶 于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7. 2~7. 4,定容至1000mL; PBST:含 0? 05% 吐温-20 的PBS; TMB显色液：A液：Na2HP04.12H20 18. 43g，柠檬酸 9. 33g，纯水定容至 1000mL;B液：60mgTMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按1 : 5体积比混合即为TMB显色液，现用现混。
[0024] 表1. 1D4单克隆抗体的亚型鉴定
抗体亚型为IgGl。
[0025] 综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡 依本发明范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
【主权项】
1. 一株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为1D4,已保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10864。2. 利巴韦林单克隆抗体，其特征在于：它由所述保藏编号为CGMCC No. 10864的利巴 韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株1D4所分泌产生。3. 权利要求2所述的利巴韦林单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全中利巴 韦林含量的检测。
【专利摘要】本发明公开了一株利巴韦林单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。本发明的方法是：利巴韦林完全抗原与等量福氏免疫佐剂TM混合均匀后，通过背部多点注射免疫BALB/c小鼠。将免疫的小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA、间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株单克隆细胞株，命名为1D4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.？10864。此细胞株1D4分泌的单克隆抗体，对利巴韦林具有较好的亲和力，亲和常数为8.04×109？L/mol，检测灵敏度IC50值为1ng/mL，可以用于食品安全中利巴韦林含量的检测。CGMCC No. 1086420150519
【IPC分类】G01N33/577, C07K16/44, C12N5/20, C12R1/91
【公开号】CN105087500
【申请号】CN201510561692
【发明人】匡华, 彭双, 胥传来, 徐丽广, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 胡拥明
【申请人】江南大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月7日