猪圆环病毒2型毒株及由其制备的灭活疫苗和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猪圆环病毒株，尤其涉及一株猪圆环病毒2型毒株，本发明还涉及由 所述猪圆环病毒2型毒株制备的灭活疫苗及其应用，属于猪圆环病毒2型毒株的分离和应 用领域。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒2型（PCV2)感染是造成断奶仔猪多系统衰竭综合征（(PMffS)的主要 原因，该病以免疫抑制和断奶仔猪多系统衰竭为特征，病猪主要表现生长发育不良、贫血、 呼吸困难、腹泻、衰弱、增重迟缓、淋巴结肿大等临床症状。同时由于是免疫抑制性疾病，机 体免疫防御功能降低，致使临床上常常发生混合感染，产生所谓的各种综合征，如：猪皮炎 肾病综合征，仔猪先天性震颤以及母猪繁殖障碍等，增加了疾病控制的难度。自1991年在 加拿大猪群中爆发以来，该病毒在全球迅速传播，目前PCV2已呈全球分布，猪群感染率越 来越高。中国于2000年首次报道PCV2以来，该病毒在中国猪场中感染率迅速上升，猪群的 平均阳性率大于20%，有的甚至超过50%，有些地区高达100%，给中国养猪业造成了巨大 的经济损失，急需采取防治措施控制该病毒的传播。
[0003] 至目前为止，国内外的试验表明，疫苗是预防此病的主要措施之一，为了有效地预 防PCV2感染，国内外相继开展了许多有关PCV2灭活疫苗和基因工程疫苗的研究，并取得了 一定效果。迄今为止，尚缺乏一种安全、高效、廉价的PCV2灭活疫苗。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一株分离的猪圆环病毒2型毒株，采用该毒株 制备的灭活疫苗免疫原性好，能够有效防治由猪圆环病毒2型引起的各种疾病。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0006] 本发明首先公开了一株分离的猪圆环病毒2型Yh-I株。
[0007] 本发明将分离的猪圆环病毒2型Yh-I株提交专利认可的机构进行保藏，其微生 物保藏编号为：CGMCCNo. 10409 ;分类名是：猪圆环病毒（Porcinecircovirus);保藏时间 是：2015年3月2日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏 地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0008] 本发明将内蒙古某发病猪场发病死亡仔猪，分别取肺脏和淋巴结，置于-70°C超低 温冰箱中保存备用。剪取一定体积病料，加入5倍体积的5%血清的MEM，使用玻璃研磨器 研磨，匀浆经12000rpm4°C离心lOmin，上清使用0. 22ym滤器过滤除菌待用；将RT-PCR 检测为阳性的病料上清过滤除菌后，接种于已长至90%的单层PK-15细胞上，每个T-25细 胞瓶lmL，放入37°C的5%CO2培养箱中孵育lh，弃上清并加入含2%胎牛血清的MEM9mL 继续37°C培养，连续传至第3代。采用微载体悬浮培养圆环病毒，得到猪圆环病毒液，连续 传15代。通过连续传代获得了稳定的高滴度的PCV-2病毒，病毒传至第4代，TCID5。值为 I.OX106'?，传至第11代时，TCID5。值达到LOX10 〃°，最终病毒的滴度稳定在LOX10〃° 左右。
[0009] 本发明猪圆环病毒2型Yh-I株能够应用于制备预防由猪圆环病毒所引起的各种 疾病的疫苗或药物。
[0010] 本发明进一步公开了一种预防由猪圆环病毒所引起的各种疾病的疫苗组合物，包 括：免疫上有效量的猪圆环病毒2型Yh-I株和药学上可接受的佐剂。
[0011] 本发明还公开了一种预防由猪圆环病毒所引起的各种疾病灭活疫苗的制备方法， 包括以下步骤：（1)扩增所述的猪圆环病毒2型Yh-I株，收获病毒液；（2)加入灭活剂灭活 病毒液，浓缩；（3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。
[0012] 其中，步骤（1)所述扩增为采用PK-15细胞培养猪圆环病毒2型Yh-I株；优选的， 将分离的猪圆环病毒2型Yh-I株按病毒维持液量的1 %接入形成PK-15细胞培养物中；所 述培养条件优选为37 °C旋转培养。
[0013]步骤⑵按照质量g/体积mL计，灭活剂与病毒液的比例为0.02 :100 ;所述灭活 剂为甲醛。
[0014] 步骤⑶所述制备水相包括：将吐温-80与浓缩后的灭活病毒液按照体积比4 :96 混合均匀，得到水相；
[0015] 所述制备油相包括：将油佐剂、司本-80、硬脂酸铝按照体积比94 :6 :2混合均匀。
[0016] 步骤⑷将水相和油相按照体积比I:1. 5的比例混合均匀。
[0017]安全性试验结果表明，本发明制备的灭活疫苗对猪安全性好，免疫前后猪没有体 温升高的现象。猪群采食和精神正常。单倍剂量和双倍剂量疫苗注射后，连续观察14d，均 未见注射部位有肿块出现，免疫后28d，每组解剖2头猪，注射部位也未见有白色油乳剂样 物质存在，疫苗吸收很完全。说明本发明的灭活疫苗接种后对猪是安全的。
[0018] 免疫原性试验结果表明，在仔猪免疫攻毒试验中，用本发明的灭活疫苗免疫后21 天，仔猪抗体全部转阳，攻毒后，免疫组保护率可达100%，所有试验动物均未发病。本发明 分离的猪圆环病毒2型Yh-I株制备的灭活疫苗保护率为100%，证明本发明分离的猪圆环 病毒2型Yh-I株免疫原性好，免疫保护力强。
[0019] 本发明所涉及到的术语宙义
[0020] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的 普通技术人员通常所了解相同的含义。
[0021] 术语"分离的"意指所指代的材料从其天然环境中取出。因此，经分离的生物材料 可以不含某些或所有细胞组分，即其中天然材料自然存在的细胞的组分（例如细胞质或膜 组分）。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，那么它是经分离的。
[0022] 可互换使用的术语"疫苗"或"疫苗组合物"指这样的药物组合物，其包括在动物 中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另 外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括 例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在 经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的 生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已 知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超 过一种上述组分。
[0023] 术语"佐剂"意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原 性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样 系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细 胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化 铝、表面活性物质。
[0024] 术语"免疫有效量"是将引发针对猪圆环病毒的免疫应答的无毒力猪圆环病毒毒 株的量。"免疫有效量"将依赖于受体动物的物种、品种、年龄、大小、健康状况等因素。
【附图说明】
[0025] 图IPCV2的PCR扩增结果；1.阴性对照；2.DL2000marker;3.PCR扩增片段。
[0026] 图2PK-15细胞分离毒的间接免疫荧光鉴定结果；A:感染分离毒的PK-15细胞； B:未感染分离毒的PK-15细胞。
[0027] 图3猪圆环病毒强毒攻毒后各组动物的体温测定结果。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入