一种纤维素酶及其基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域和酶工程领域，具体涉及一种纤维素酶及编码该酶的基 因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素是地球上非常丰富的可再生资源，在中国这样的农业大国其来源广泛，但 是目前的利用率却十分低下。这主要是因为在自然条件下的纤维素资源常与木质素、半纤 维素等物质结合在一起，并且纤维素具有水不容性的高结晶构造，使得纤维素在自然条件 下难以被高效、迅速地分解。目前使用纤维素酶对其进行降解是一个切实可行并且有效的 方法，因此，如何开发新的能高效、充分利用纤维素的酶制剂是至关重要的。
[0003] 纤维素是一种大分子多糖，其结构只要是由D-葡萄糖以0 -1，4-糖苷键相联结而 构成的具有复杂结构的结晶分子，分子量50000-2500000。其分子间存在氢键，通常情况下 比较稳定，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。在一定的条件下，纤维素 可与水发生水解反应，氧桥断裂，同时水分子加入，纤维素由长链分子变为短链分子，直至 氧桥全部断裂，最终产物是葡萄糖分子。
[0004] 纤维素酶是指能够水解纤维素P-1，4-葡萄糖苷键，使得纤维素变成纤维二糖 和葡萄糖的一类酶系的总称，根据对糖苷键不同的催化作用，可以分为外切葡聚糖苷酶 (1，4- 0 -D-glucanase或exo-1, 4- 0 -D-glucanase，EC3. 2. 1. 91，来自真菌的简称CBH，来 自细菌的简称Cex)，内切葡聚糖苷酶（1，4-0 -D-glueanase或endo-1, 4-0 -D-glueanase， EC3. 2. 1.4,CMC酶，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Cen)和(6-葡聚糖苷酶 (0 -1，4-glucosidase，EC3. 2. 1. 21，简称BG) 〇
[0005] 纤维素酶降解纤维素是酶的各组分之间协同作用的结果，目前主要有两种观 点：一种认为，首先由内切葡聚糖苷酶（EG)作用于纤维素分子内部的无定型区，随机水解 0-1，4-糖苷键，将长的纤维素分子截短，产生大量不同长度的带非还原性末端的小分子纤 维素，然后再由外切葡聚糖酶（CBH)由末端水解纤维二糖，每次切下1个纤维二糖分子，最 后由(6-葡聚糖苷酶（BG)将纤维二糖以及短链的纤维寡糖水解为葡萄糖。另一种观点则 认为首先是由CBH水解不溶性纤维素使其变为可溶性的纤维糊精和纤维二糖，然后由EG将 纤维糊精生产纤维二糖，再由BG将纤维二糖分解成两个葡萄糖。
[0006] 在纤维素酶的研究中，对产纤维素酶菌株进行筛选是最常用的办法，但是自然环 境中筛选得到的产纤维素酶菌株往往具有一些缺陷，如活性低，生产缓慢，培养基要求高 等。所以从细菌和真菌中克隆纤维素酶基因，然后在表达系统中进行异源表达构建能产生 高性能纤维素酶的工程菌是一个很好的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种纤维素酶，编码该酶的基因， 含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。
[0008] 本发明采用的技术方案如下： 本发明旨在提供一种从芽孢杆菌sp)(菌株保藏号：CGMCCNo. 5312)中分 离得到的纤维素酶基因CdJ(该菌株公开在申请号201110435707. 1的专利中），该基因核 苷酸序列或核苷酸序列的片段如SEQIDNO:1所示，或与SEQIDNO:1互补的核苷酸序列， 该基因序列长度为1041bp(碱基），该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0009] 本发明的核苷酸序列是DNA形式的，包括CDNA、基因组DNA或人工合成的DNA，可 以是单链的或是双链的。由于核苷酸序列的特殊性，任何与SEQIDNO:1所示的核苷酸序 列具有80%以上同源性且具有相同功能的多核苷酸变体，均在本发明的保护范围之内。所 述多核苷酸变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列，可以使用本领域所 熟知的取代、缺失或插入变异来获得。
[0010] 本发明中的纤维素酶基因编码的氨基酸序列是具有SEQIDNO:2所示的氨基酸残 基序列的多肽或蛋白质。由于氨基酸序列的特殊性，只要是含有SEQIDNO:2所示氨基酸 序列的多肽片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物与SEQIDNO:2所示的 氨基酸残基序列具有90%以上同源性且具有相同活性的蛋白质，均在本发明的保护范围之 内。这些方法包括氨基酸序列中氨基酸残基的缺失、插入、化学修饰或替换，所述蛋白可以 是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白。
[0011] 本发明的另一目的是提供一种含有纤维素酶基因的重组表达载体，是将SEQID NO:1所示基因直接与不同表达载体连接所构建的重组载体。
[0012] 本发明中，编码纤维素酶的多核苷酸序列可以插入到载体中，以构成含有本发明 所述的重组载体。载体是指本领域所熟知的质粒、病毒或其他载体，建议优选PET载体系列 及其他原核表达载体。可用本领域技术人员熟知的方法来构建含编码纤维素酶的核苷酸序 列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技 术、体内重组技术等。所述编码纤维素酶的核苷酸序列可以有效连接到表达载体中的适当 启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的Iac或trp启动 子；A噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和 晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细 胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子 等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA 表达的顺式作用因子，通常大约有10_300bp，作用于启动子以增强基因的转录，如腺病毒增 强子。
[0013] 本发明中，编码纤维素酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可以用本领域 的技术人员熟知的方法转化或者导入到宿主细胞中，该细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、植 物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代，代表性例子有：大肠杆菌；真菌细胞或酵母； 植物细胞如油菜、烟草、大豆；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9 ;动物细胞如CH0、COS或Bowes黑 色素瘤细胞等。
[0014] 本发明还涉及所述编码基因在制备重组纤维素酶中的应用，通过常规的重组DNA 技术，利用本发明的多核苷酸序列可以构建表达或生产重组的纤维素酶。一般来说可以通 过以下步骤实现：构建重组载体，转化入宿主细胞构建重组细胞，在合适的培养基中培养宿 主细胞，从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0015] 本发明与现有技术相比，有很多突出效果。本发