外泌体提取试剂盒及其在肿瘤等疾病液体活检中的应用
外泌体提取试剂盒及其在肿瘤等疾病液体活检中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种从生物样品中提取RNA的方 法、试剂盒以及采用该方法提取的RNA的应用。
【背景技术】
[0002] 由于血液、唾液等生物样品能够反应整个机体的生理病理状态。以血清唾液为例 的液体诊断具有以下优点：1、创伤小，病人依从性好；2、收集方便，利于存储；3、简单方便 易操作，成本低廉。因此曾有研究者试图从血清、唾液等生物样品中提取RNA用做肿瘤的早 期诊断、筛查及诊治等，但由于RNA在提取过程中容易降解，且直接从生物样品如血清、唾 液中等提取难度较大，因此，需要一种能够从生物样品中方便、准确地提取RNA的方法。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种能够从生物 样品中方便、准确地提取RNA的方法。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种提取RNA的方法，包括：
[0005] S1、将生物样品离心以获得上清液；
[0006] S2、在所述上清液中加入外泌体沉淀溶液，在混匀、离心之后获得外泌体沉淀物；
[0007] S3、在所述外泌体沉淀物中加入总RNA抽提试剂以及等体积的酒精，剧烈混合之 后加入吸附柱；
[0008] S4、离心所述吸附柱，且之后加入RNA预洗液、RNA清洗缓冲液以及去离子水反复 冲洗并离心以获得总RNA。
[0009] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S2包括：
[0010] S21、在所述上清液中加入ExoQuick外泌体沉淀溶液混匀，室温孵育或低温混匀 过夜，然后以1000_2000g/分钟的速度离心20-40分钟，以形成外泌体沉淀物；
[0011] S22、移除上清液，再次离心剩余混合溶液，以1000-2000g/分钟的速度离心2-10 分钟；
[0012] S23、移除所有液体，以1000-2000g/分钟的速度离心空转2-10分钟，以获得所述 外泌体沉淀物。
[0013] 在本发明所述的提取RNA的方法中，在所述步骤S2中，所述生物样品和所述 ExoQuick外泌体沉淀溶液的体积比为3. 5-4. 5 :1，所述室温孵育时间为10-40分钟。
[0014] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S3进一步包括：
[0015] S31、确认所述外泌体沉淀物；
[0016] S32、在所述外泌体沉淀物中加入Trizol溶液形成混合溶液；
[0017] S33、根据所述混合溶液的体积加入等体积酒精，剧烈混合5-20秒；
[0018] S34、将混匀的溶液加入吸附柱中。
[0019] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S31包括：
[0020] S311、采用电镜确认所述外泌体沉淀物；
[0021] S3la、采用免疫印迹确认所述外泌体沉淀物；或
[0022] S31A、采用NanoSight确认所述外泌体沉淀物。
[0023] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S4进一步包括：
[0024] S41、将所述吸附柱放入收集管中，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟；
[0025] S42、将所述吸附柱放入新的收集管中，加入RNA预洗剂，以10000g-15000g/分钟 的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液，且重复此步骤1-5次；
[0026] S43、在吸附柱中加入RNA清洗缓冲液，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分 钟，丢弃收集官中的废液；
[0027] S44、在吸附柱中加入去离子水，以离心机的最大转速旋转1-2分钟以获得所述 RNA0
[0028] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述RNA包括G0LM1-MAK10、ASTN2-PAPPA、 FAM18B2-CDRT4、HSP90B1-C12orf73、PTPRO、CoAA、CoAM、P-Actin、GAPDH。
[0029] 本发明解决其技术问题采用的另一技术方案是，构造一种提取RNA的试剂盒，包 括：ExoQuick外泌体沉淀溶液、Trizol溶液、酒精和RNA预洗剂。
[0030] 本发明还涉及采用本发明的提取RNA的方法所获得的PTPRO在用于乳腺癌诊断和 治疗的药物中的应用。
[0031] 本发明还涉及采用本发明的提取RNA的方法所获得的G0LM1-MAK10在用于食管癌 诊断和治疗的药物中的应用。
[0032] 实施本发明的提取RNA的方法、试剂盒，能够从生物样品中方便、准确地提取RNA， 并且通过本发明获得的PTPR0,可以诊断乳腺癌，而通过本发明获得的G0LM1-MAK10,能够 诊断食管癌，因此本发明中运用血清、唾液等生物样品提取外泌体，并从中准确的提取RNA， 能够对肿瘤进行早期诊断、筛查、治疗等。且本发明提取的RNA可用于基因二代测序，能够 实时监测全面了解被检者的基因状态，达到精确检测，精确诊治，并能预测罹患疾病的可能 性或指导临床诊治，对患者进行个体化靶向性的治疗。实施本发明提供了一种优化简单的 液体诊断方法。
【附图说明】
[0033] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0034] 图1是本发明的提取RNA的方法的优选实施例的流程图；
[0035] 图2示出了电镜下观察到的外泌体；
[0036] 图3示出了两例食管癌患者外周血中提取的外泌体特异性标记⑶9的免疫印迹， 患者编号分别为NO. 109、NO. 107 ;
[0037] 图4示出了不同食管癌以及良性食管疾病或正常患者外周血血清中融合RNA的 G0LM1-MAK10的定量分析结果；
[0038] 图5示出了融合RNAG0LM1-MAK10特异性敏感性示意图；
[0039] 图6示出了NanoSight分析出的唾液外泌体的大小及浓度；
[0040] 图7示出了食管癌患者以及正常受试者的唾液中提取的外泌体中融合RNA的 G0LM1-MAK10的定量分析结果；
[0041] 图8示出了放化疗敏感食管癌患者以及放化疗耐受食管癌的唾液中提取的外泌 体中PTPRO的PCR结果，其中S代表放化疗敏感的食管癌患者；R代表放化疗耐受的食管癌 患者；
[0042] 图9示出了乳腺癌早期、晚期患者以及正常受试者的唾液中提取的外泌体中 PTPRO的PCR分析结果；
[0043] 图10示出了乳腺癌患者术前术后PTPRO的表达差异；
[0044] 图11示出了乳腺癌术前PTPRO表达差异与患者预后的关系。
【具体实施方式】
[0045] 恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，是人类疾病三大主要死亡原因之一， 占所有疾病死因的四分之一。
[0046] 食管癌是消化系统最常见的肿瘤之一，根据世界卫生组织（WHO)报道，2012年全 球因为食管癌死亡患者为40万例，位居肿瘤第六位。2014年我国食管癌其死亡率位居我国 恶性肿瘤的第四位。早期食管癌的症状不显著，大多数病人发现时或出现临床症状时已经 临近中晚期，尽管随着科技医疗技术的发展，食管癌的诊疗水平有所提高，但5年生存率依 旧较低。而早期食管癌经手术等治疗后，5年生存率能达到80%以上。故而食管癌的早期 诊断显得十分重要，能显著提高食管癌患者的生存预后。目前的细胞和组织病理学检测包 括细胞活检因此需要采用穿刺或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不 方便，而且会对患者造成人体伤害。
[0047] 根据我们团队的研究表明，融合RNA，这种由不同染色体上各自的RNA在转录 水平切割和错读所导致的RNA，在食管癌中普遍存在，其中G0LM1-MAK10、ASTN2-PAPPA、 FAM18B2-CDRT4、HSP90B1-C12orf73等在食管鳞癌中显著的高表达，而且有些融合RNA如 G0LM1-MAK10可以分泌到细胞外，参与细胞间通信，影响细胞的功能等。大样本数据显示其 中G0LM1-MAK10的表达与食管癌患者的淋巴结转移、肿瘤的分化等密切相关，可以作为食 管鳞癌的特异性分子标志物。
[0048] 此外，我们的团队还发现食管癌、乳腺癌中的特异性的基因如PTPRO等与食管癌、 乳腺癌患者的放疗敏感性关系密切，且在食管癌常用化疗药物耐药机制中起重要作用，这 具有潜在的对病人放化疗敏感性进行分层的价值，从而指导制定个体化的放疗方案，提高 食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤的疗效。
[0049] 由于食管癌、乳腺癌的诊断目前主要以细胞和组织病理学检测为主，包括细胞活 检，因此需要采用穿刺或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而 且会对患者造成人体伤害，我们还希望可以寻找一种简单方便的无创性的液体诊断。
[0050] 外泌体是由多种活细胞分泌的，天然存在于体液中，由双层脂质膜所包围的扁平 型半球体，其直径约为30-100nm。这种普遍存在于机体内的被膜结构，在30年前被人们所 发现，以往普遍认为其仅仅执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发 下游信号事件。
[0051] 然而，近期的研究发现外泌体还可以运输核酸，参与细胞间通讯，参与细胞间的物 质交换和信息交流，影响细胞的生理状态，并与多种疾病的发生与进程密切相关。目前的研 究表明：外泌体在血液、唾液、尿液、腹水、胸水、母乳和汗液、泪液、脑脊液等体液中均具有 较高的丰度，且其中含有蛋白质、RNA和脂肪成分。外泌体不仅可以保护细胞分泌的RNA稳 定存在，还可以保护细胞合成过程中的中间产物，还能够作为有效的载体将RNA转运到特 定的靶细胞中，发挥重要的调控作用。肿瘤细胞分泌的外泌体，可进入淋巴系统和肿瘤组织 内的毛细血管，发挥对恶性肿瘤抑制或促进的双重调控作用，且外泌体能与肿瘤抑制因子 相互作用，共同参与对肿瘤生长的调控。由于肿瘤细胞分泌的外泌体是调控肿瘤发生发展 的重要机制，对肿瘤外泌体进行分析和检测从而可以辅助肿瘤的早期诊断、筛查、疗效评价 和预后分析。此外，人体内抗原提呈细胞（antigen-presentingcell，APC)分泌的外泌体 还可以刺
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，涉及一种从生物样品中提取RNA的方 法、试剂盒以及采用该方法提取的RNA的应用。
【背景技术】
[0002] 由于血液、唾液等生物样品能够反应整个机体的生理病理状态。以血清唾液为例 的液体诊断具有以下优点：1、创伤小，病人依从性好；2、收集方便，利于存储；3、简单方便 易操作，成本低廉。因此曾有研究者试图从血清、唾液等生物样品中提取RNA用做肿瘤的早 期诊断、筛查及诊治等，但由于RNA在提取过程中容易降解，且直接从生物样品如血清、唾 液中等提取难度较大，因此，需要一种能够从生物样品中方便、准确地提取RNA的方法。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种能够从生物 样品中方便、准确地提取RNA的方法。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种提取RNA的方法，包括：
[0005] S1、将生物样品离心以获得上清液；
[0006] S2、在所述上清液中加入外泌体沉淀溶液，在混匀、离心之后获得外泌体沉淀物；
[0007] S3、在所述外泌体沉淀物中加入总RNA抽提试剂以及等体积的酒精，剧烈混合之 后加入吸附柱；
[0008] S4、离心所述吸附柱，且之后加入RNA预洗液、RNA清洗缓冲液以及去离子水反复 冲洗并离心以获得总RNA。
[0009] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S2包括：
[0010] S21、在所述上清液中加入ExoQuick外泌体沉淀溶液混匀，室温孵育或低温混匀 过夜，然后以1000_2000g/分钟的速度离心20-40分钟，以形成外泌体沉淀物；
[0011] S22、移除上清液，再次离心剩余混合溶液，以1000-2000g/分钟的速度离心2-10 分钟；
[0012] S23、移除所有液体，以1000-2000g/分钟的速度离心空转2-10分钟，以获得所述 外泌体沉淀物。
[0013] 在本发明所述的提取RNA的方法中，在所述步骤S2中，所述生物样品和所述 ExoQuick外泌体沉淀溶液的体积比为3. 5-4. 5 :1，所述室温孵育时间为10-40分钟。
[0014] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S3进一步包括：
[0015] S31、确认所述外泌体沉淀物；
[0016] S32、在所述外泌体沉淀物中加入Trizol溶液形成混合溶液；
[0017] S33、根据所述混合溶液的体积加入等体积酒精，剧烈混合5-20秒；
[0018] S34、将混匀的溶液加入吸附柱中。
[0019] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S31包括：
[0020] S311、采用电镜确认所述外泌体沉淀物；
[0021] S3la、采用免疫印迹确认所述外泌体沉淀物；或
[0022] S31A、采用NanoSight确认所述外泌体沉淀物。
[0023] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述步骤S4进一步包括：
[0024] S41、将所述吸附柱放入收集管中，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分钟；
[0025] S42、将所述吸附柱放入新的收集管中，加入RNA预洗剂，以10000g-15000g/分钟 的速度离心1-2分钟，丢弃收集管中的废液，且重复此步骤1-5次；
[0026] S43、在吸附柱中加入RNA清洗缓冲液，以10000g-15000g/分钟的速度离心1-2分 钟，丢弃收集官中的废液；
[0027] S44、在吸附柱中加入去离子水，以离心机的最大转速旋转1-2分钟以获得所述 RNA0
[0028] 在本发明所述的提取RNA的方法中，所述RNA包括G0LM1-MAK10、ASTN2-PAPPA、 FAM18B2-CDRT4、HSP90B1-C12orf73、PTPRO、CoAA、CoAM、P-Actin、GAPDH。
[0029] 本发明解决其技术问题采用的另一技术方案是，构造一种提取RNA的试剂盒，包 括：ExoQuick外泌体沉淀溶液、Trizol溶液、酒精和RNA预洗剂。
[0030] 本发明还涉及采用本发明的提取RNA的方法所获得的PTPRO在用于乳腺癌诊断和 治疗的药物中的应用。
[0031] 本发明还涉及采用本发明的提取RNA的方法所获得的G0LM1-MAK10在用于食管癌 诊断和治疗的药物中的应用。
[0032] 实施本发明的提取RNA的方法、试剂盒，能够从生物样品中方便、准确地提取RNA， 并且通过本发明获得的PTPR0,可以诊断乳腺癌，而通过本发明获得的G0LM1-MAK10,能够 诊断食管癌，因此本发明中运用血清、唾液等生物样品提取外泌体，并从中准确的提取RNA， 能够对肿瘤进行早期诊断、筛查、治疗等。且本发明提取的RNA可用于基因二代测序，能够 实时监测全面了解被检者的基因状态，达到精确检测，精确诊治，并能预测罹患疾病的可能 性或指导临床诊治，对患者进行个体化靶向性的治疗。实施本发明提供了一种优化简单的 液体诊断方法。
【附图说明】
[0033] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0034] 图1是本发明的提取RNA的方法的优选实施例的流程图；
[0035] 图2示出了电镜下观察到的外泌体；
[0036] 图3示出了两例食管癌患者外周血中提取的外泌体特异性标记⑶9的免疫印迹， 患者编号分别为NO. 109、NO. 107 ;
[0037] 图4示出了不同食管癌以及良性食管疾病或正常患者外周血血清中融合RNA的 G0LM1-MAK10的定量分析结果；
[0038] 图5示出了融合RNAG0LM1-MAK10特异性敏感性示意图；
[0039] 图6示出了NanoSight分析出的唾液外泌体的大小及浓度；
[0040] 图7示出了食管癌患者以及正常受试者的唾液中提取的外泌体中融合RNA的 G0LM1-MAK10的定量分析结果；
[0041] 图8示出了放化疗敏感食管癌患者以及放化疗耐受食管癌的唾液中提取的外泌 体中PTPRO的PCR结果，其中S代表放化疗敏感的食管癌患者；R代表放化疗耐受的食管癌 患者；
[0042] 图9示出了乳腺癌早期、晚期患者以及正常受试者的唾液中提取的外泌体中 PTPRO的PCR分析结果；
[0043] 图10示出了乳腺癌患者术前术后PTPRO的表达差异；
[0044] 图11示出了乳腺癌术前PTPRO表达差异与患者预后的关系。
【具体实施方式】
[0045] 恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一，是人类疾病三大主要死亡原因之一， 占所有疾病死因的四分之一。
[0046] 食管癌是消化系统最常见的肿瘤之一，根据世界卫生组织（WHO)报道，2012年全 球因为食管癌死亡患者为40万例，位居肿瘤第六位。2014年我国食管癌其死亡率位居我国 恶性肿瘤的第四位。早期食管癌的症状不显著，大多数病人发现时或出现临床症状时已经 临近中晚期，尽管随着科技医疗技术的发展，食管癌的诊疗水平有所提高，但5年生存率依 旧较低。而早期食管癌经手术等治疗后，5年生存率能达到80%以上。故而食管癌的早期 诊断显得十分重要，能显著提高食管癌患者的生存预后。目前的细胞和组织病理学检测包 括细胞活检因此需要采用穿刺或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不 方便，而且会对患者造成人体伤害。
[0047] 根据我们团队的研究表明，融合RNA，这种由不同染色体上各自的RNA在转录 水平切割和错读所导致的RNA，在食管癌中普遍存在，其中G0LM1-MAK10、ASTN2-PAPPA、 FAM18B2-CDRT4、HSP90B1-C12orf73等在食管鳞癌中显著的高表达，而且有些融合RNA如 G0LM1-MAK10可以分泌到细胞外，参与细胞间通信，影响细胞的功能等。大样本数据显示其 中G0LM1-MAK10的表达与食管癌患者的淋巴结转移、肿瘤的分化等密切相关，可以作为食 管鳞癌的特异性分子标志物。
[0048] 此外，我们的团队还发现食管癌、乳腺癌中的特异性的基因如PTPRO等与食管癌、 乳腺癌患者的放疗敏感性关系密切，且在食管癌常用化疗药物耐药机制中起重要作用，这 具有潜在的对病人放化疗敏感性进行分层的价值，从而指导制定个体化的放疗方案，提高 食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤的疗效。
[0049] 由于食管癌、乳腺癌的诊断目前主要以细胞和组织病理学检测为主，包括细胞活 检，因此需要采用穿刺或者外科手术的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而 且会对患者造成人体伤害，我们还希望可以寻找一种简单方便的无创性的液体诊断。
[0050] 外泌体是由多种活细胞分泌的，天然存在于体液中，由双层脂质膜所包围的扁平 型半球体，其直径约为30-100nm。这种普遍存在于机体内的被膜结构，在30年前被人们所 发现，以往普遍认为其仅仅执行蛋白运输功能，特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发 下游信号事件。
[0051] 然而，近期的研究发现外泌体还可以运输核酸，参与细胞间通讯，参与细胞间的物 质交换和信息交流，影响细胞的生理状态，并与多种疾病的发生与进程密切相关。目前的研 究表明：外泌体在血液、唾液、尿液、腹水、胸水、母乳和汗液、泪液、脑脊液等体液中均具有 较高的丰度，且其中含有蛋白质、RNA和脂肪成分。外泌体不仅可以保护细胞分泌的RNA稳 定存在，还可以保护细胞合成过程中的中间产物，还能够作为有效的载体将RNA转运到特 定的靶细胞中，发挥重要的调控作用。肿瘤细胞分泌的外泌体，可进入淋巴系统和肿瘤组织 内的毛细血管，发挥对恶性肿瘤抑制或促进的双重调控作用，且外泌体能与肿瘤抑制因子 相互作用，共同参与对肿瘤生长的调控。由于肿瘤细胞分泌的外泌体是调控肿瘤发生发展 的重要机制，对肿瘤外泌体进行分析和检测从而可以辅助肿瘤的早期诊断、筛查、疗效评价 和预后分析。此外，人体内抗原提呈细胞（antigen-presentingcell，APC)分泌的外泌体 还可以刺
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0137751... 来自[江苏省常州市电信] 2019年11月01日 14:02感谢分享~BIOG cfRNA Easy Kit提取RNA纯度高，可用于血清、血浆、胸腹水、脑脊液、滑膜液等游离样本中RNA的提取。
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