一种基于目标触发的可二次扩增的探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物信息学领域，具体涉及一种基于目标触发的可二次扩增的探 针及其应用。
【背景技术】
[0002] 在突变分析、临床诊断和基因治疗中，微量DNA的检测起着至关重要的作用。为了 检测微量的DNA，则需要构建检测灵敏度高的DNA生物传感器。目前，有采用信号扩增策略 来实现高灵敏度检测的传感器，这些高灵敏度的传感器主要集中于核酸研究的领域，采用 的扩增方法包括聚合酶链反应（PCR)、连接酶链式反应（LCR)、链置换扩增（SDA)和滚环扩 增（RCA)等。虽然采用上述方法可以实现对目标检测物的高灵敏分析，但是通常涉及多个 分析步骤，并且需要加入许多外源试剂。因此，目前亟待提出一种操作简单、成本低同时具 有高灵敏度的检测微量DNA的方法。
[0003]脱氧核酶（DNA酶）属于人工核酸的一种，通过体外选择被分离出来，具有对特定 底物的高催化活性、较好的热稳定性，可以多次变性复性而不丢失催化活性等优点，是生物 应用中理想的信号扩增的生物催化剂。在DNA酶领域，G-四链体-氯血红素DNA酶的发现 引起了广泛的关注。G-四链体序列可以结合辅助因子一氯化血红素，形成仿过氧化物酶 DNA酶，进而将H2O2介导的2, 2' -联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS2)催化氧化 成绿色的ABTS'，或提高鲁米诺-过氧化氢体系的化学发光。基于该原理，G-四链体-氯 血红素DNA酶已被开发出了许多比色、化学发光或荧光的传感平台。但是利用上述原理进 行DNA分析的比色探针较为少见，更无法达到检测微量DNA的灵敏度。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的第一个技术问题是现有技术中检测微量DNA分析步骤复杂、需 要加入许多外源试剂，进而提供一种操作简单、成本低同时具有高灵敏度的检测微量DNA 的方法。
[0005] 本发明所要解决的第二个技术问题是现有技术中基于G-四链体-氯血红素DNA 酶的探针无法达到检测微量DNA的灵敏度，进而提供一种基于目标触发的可二次扩增的、 可检测微量DNA的、高灵敏度的探针。
[0006] 本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针，所述探针包括第一发夹、第二发夹 以及第三发夹；所述第一发夹、第二发夹以及第三发夹均为单链线形分子自身回折后，折叠 区域内的互补碱基配对杂交而成，其局部区域形成双链结构的部分为茎干区，未形成双链 结构并回折的部分为环状区；
[0007] 所述第一发夹包括：识别目标DNA的识别区以及与所述识别区部分杂交形成发夹 结构的第一茎干区；
[0008] 所述第二发夹包括：与所述第一发夹的识别区部分杂交的碱基互补区；
[0009]所述第三发夹包括：可与所述第一发夹的第一茎干区部分杂交的第二茎干区以及 G-四链体区。
[0010] 发夹结构是指，DNA单链线形分子自身回折后，折叠区域内的互补碱基配对杂交而 形成的结构。本发明中，所述第一发夹、第二发夹、第三发夹的环状区是指，在发夹结构中， 未形成双链结构的、回折的部分。所述茎干区是指，形成双链结构的部分。所述第一茎干区、 第二茎干区可以是完整的茎干区，也可以是所述茎干区的一部分。
[0011] 所述G-四链体区具有如SEQIDNo. 1所示的序列结构，序列SEQIDNo. 1为： 5'-TATGGGTTGGGCGGGATGGG-3'。
[0012] 所述第一发夹、第二发夹、第三发夹中，所述环状区的碱基个数与所述茎干区的碱 基个数的比值大于2。
[0013] 所述第一发夹、第二发夹、第三发夹中，所述茎干区的序列长度为5-16个碱基，且 在所述碱基中，胞嘧啶和鸟嘌呤的个数分别占总碱基数的60%以下。
[0014] 所述第一发夹、第二发夹、第三发夹的5'端的第一个碱基为胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺 嘧啶、尿嘧啶中的一种。
[0015] 作为本发明的具体设计方式，所述第一发夹具有如SEQIDNo. 2所示的结构，所述 第二发夹具有如SEQIDNo. 3所示的结构，所述第三发夹具有如SEQIDNo. 4所示的结构。 具体来说，
[0016]序列SEQIDNo. 2 为：5,-GTGACTAGATCTACATATTGCCATCTGTAACAATAT GTAGATCTATGGGTTTTTT-3' ；
[0017]序列SEQIDNo. 3 为：5，-TATTGTTACAGATGGCAATATGTAGATCTACCATCT GTAATTTT-3' ；
[0018]序列SEQIDNo. 4 为：5，-TATGGGTTGGGCGGGATGGGAACCCATAGATCT ACA-3，。
[0019] 本发明的检测DNA分子的方法，利用上述基于目标触发的可二次扩增的探针进行 检测。包括以下步骤：将所述的基于目标触发的可二次扩增的探针置于待测溶液中，并加 入核酸外切酶111，5-351：下培育4-101 1，然后向其中加入氯化血红素培育，并加入2,2-联 氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐以及过氧化氢混匀反应，观察或检测混合液 的发光或变色情况。
[0020] 进一步的，所述方法还包括在在加入所述待测溶液前，将所述探针先缓慢加热至 95°C，保持5-10分钟，然后在至少2小时以上的时间内，将其缓慢冷却至室温的步骤。
[0021] 进一步的，加入氯化血红素的同时还包括加入氢离子缓冲液的步骤。优选的，所述 缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。
[0022] 进一步的，所述氯化血红素加入后，培育30_90min再加入2, 2-联氮-二（3-乙 基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐以及过氧化氢。
[0023] 本发明所述的基于目标触发的可二次扩增的探针在检测DNA分子领域的用途。
[0024] 作为本发明的优选实现方式，所述DNA分子具有如SEQIDNo. 5、SEQIDNo. 6、 SEQIDNo. 7、SEQIDNo. 8、SEQIDNo. 9、SEQIDNo. 10、SEQIDNo. 11 所示的结构，具体 包括：
[0032] 本发明中，所述的核酸外切酶III(ExoIII )是一个不依赖序列的酶，不需要特定的 酶切识别位点。它可以逐步催化水解移除带有3'-平末端或凹末端的双链DNA上的单核苷 酸，但对于3'末端突出的双链DNA或者单链DNA表现出有限的催化水解活性。
[0033] 本发明所述的基于目标触发的可二次扩增的探针检测目标DNA的原理如下：反应 体系中，所述第一发夹的识别区识别目标DNA，并与之结合，使所述第一发夹打开，识别区剩 余部分以及第一茎干区以单链形式被释放出来；被释放的所述识别区剩余部分以及所述第 一茎干区与第二发夹杂交，形成复合物第一发夹-目标DNA-第二发夹；由于复合物第一发 夹-目标DNA-第二发夹不稳定，目标DNA随即便从复合物中分离出来，留下带有3' -凸末 端的第一发夹-第二发夹双链；分离出来的目标DNA又可以与新的第一发夹结合，从而引发 目标DNA的循环扩增；留下带有3' -凸末端的第一发夹-第二发夹双链，可与所述第三发 夹的第二茎干区杂交，形成复合物第一发夹-第二发夹-第三发夹；形成的复合物第一发 夹-第二发夹-第三发夹可被核酸外切酶III识别，进而特异性的剪切带有3'平末端或凹末 端的DNA双链，即将第一发夹-第二发夹-第三发夹复合物上的第三发夹以3' -向-5'的 方向从3'-平末端开始逐步水解单核苷酸，从而释放出第一发夹-第二发夹双链与G-四链 体序列；被释放处的第一发夹-第二发夹则可自由地结合新的第三发夹，从而引发核酸外 切酶III的剪切反应，形成循环，并释放处更多的G-四链体序列；被释放的G-四链体可与氯 化血红素相互作用，形成具有催化活性的仿过氧化物酶的G-四链体-氯血红素DNA酶，通 过H2O2将ABTS2催化氧化成绿色的ABTS?。
[0034] 本发明的上述技术方案，相比现有技术具有以下优点：
[0035] (1)本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针，巧妙的设计出所述第一发夹、第 二发夹、第三发夹，可在核酸外切酶III存在的情况下，经目标DNA触发，形成两个独立的循 环反应，使检测目标DNA时发生两次扩增，显著的增强了信号，大大提高了检测目标DNA的 灵敏度，检测限可降低至〇. 36pM，并具有超过5个数量级的宽动态检测范围，可满足微量 DNA的检测要求；
[0036] (2)本发明的基于目标触发的可二次扩增的探针，所述第一发夹包括识别区与第 一茎干区，在反应体系中不存在目标DNA时，保持发夹结构，所述第二发夹、第三发夹也无 法与第一发夹发生反应，在该应体系中三种发夹结构均保持稳定的状态，不产生信号；只有 当目标DNA存在时，才会触发所述第一发夹打开，进而打开所述第二发夹、所述第三发夹， 从而产生信号。因此，上述探针不仅具有良好的特异性，并且检测DNA分子的整个反应可以 在等温、均一的溶液中进行，大大的简化了检测DNA分子、乃至微量DNA的检测操作，无需加 入过多的外源试剂、无需复杂耗时的热循环反应，操作简单、方便；