斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种组织和器官特异性表达基因的增强子捕获技术领域，尤其涉及一 种斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用，用于荧光标记斑马鱼胚胎发育过程中的 神经细胞。
【背景技术】
[0002] 增强子捕获技术是一种研究基因组中存在的增强子序列的正向遗传学方法之一， 它用于发现已知及未知的组织特异表达的增强子元件。过去几十年来，国内外采用增强子 捕获技术，获得了多种组织和器官特异表达荧光的斑马鱼品系，而对相关基因位点插入信 息获得较少，很多组织器官如神经系统、肝脏、胰腺和肾脏等特异表达的增强子和启动子尚 未被克隆。神经系统发育是发育生物学研究的热点之一，目前已获得一些荧光标记神经系 统的转基因斑马鱼品系，它们被广泛用于神经突触及神经递质传递方面的研究。神经系统 发育及信号调控的精密性和复杂性，需要更多标记不同神经细胞的转基因品系的出现。
[0003] 经检索，目前尚未发现相同于本发明的对斑马鱼神经组织特异性增强子的克隆。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就在于克服现有研究中神经组织特异性增强子较少的问题，提供一 种斑马鱼神经组织特异性增强子及其克隆和应用，即通过增强子捕获载体建立神经系统特 异表达荧光的转基因斑马鱼，克隆获得了一种在神经组织特异表达的增强子序列。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 一、斑马鱼神经组织特异性增强子
[0007] 该增强子位于斑马鱼基因组第7号染色体90kb的区域（Zv9,染色体7: 15189000-15279000)，特异表达在斑马鱼前脑、中脑、后脑、脊髓和眼睛神经组织中；其序 列为SEQIDNO. 2所示的核苷酸序列。
[0008] 二、斑马鱼神经组织特异性增强子的克隆方法
[0009] ①所采用的增强子捕获载体
[0010] 具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，长4881bp，由mMTl弱启动子驱动绿色荧光 蛋白报告基因、剪接受体SA和T〇12转座子三部分组成；
[0011] ②神经组织特异性表达绿色荧光蛋白的转基因鱼的获得
[0012] 通过斑马鱼胚胎显微注射、绿色荧光蛋白荧光筛选以及原位杂交与切片分析，获 得神经组织特异表达荧光的斑马鱼；
[0013] 具体地，采用T〇12转座子系统，进行斑马鱼基因转移。采用显微注射的方式将转 基因载体导入斑马鱼单细胞期胚胎，通过绿色荧光蛋白表达观察，获得代转基因鱼个 体。将R)代性性成熟鱼与野生型鱼进行测交获得Fl代胚胎，绿色荧光蛋白荧光筛选神经 组织异表达荧光的Fl代阳性鱼。由于Fl代多数来源于嵌合体胚胎，具有不同的插入位点 等遗传背景，因此，将Fl代阳性鱼与野生型鱼进行测交获得同一遗传背景的F2代。将F2 代阳性鱼自交得到F3代，即可获得稳定的神经组织特异表达绿色荧光蛋白的斑马鱼品系， 我们命名为PTME12。激光共聚焦显微镜观察、整体原位杂交与冰冻切片分析，进一步证实了 绿色荧光蛋白特异性表达在斑马鱼神经组织。
[0014] ③增强子的克隆
[0015] 通过染色体步移与基因组序列电子克隆，获得神经组织特异性增强子；
[0016] 采用染色体步移方法：我们发现增强子捕获载体正向插入到rhcga基因编码区 下游46kb的非编码区，并以反方向位于kif7基因编码区的下游45kb处。我们将斑马鱼， 虎河豚，青鏘鱼中位于rhcga和kif7基因之间的基因组序列进行比较基因组学分析，利用 mVISTA软件，我们在斑马鱼基因组90kb的染色体区域（Zv9,染色体7:15189000-15279000) 获得4个高度保守（序列长度大于IOObp并具有>75%的一致性）的非编码元件。随后， 我们将四个CNE序列分别克隆到pTME载体中mMTI启动子的上游，进行斑马鱼胚胎显微注 射、绿色荧光蛋白表达分析，获得一个潜在的驱动绿色荧光蛋白在神经组织特异表达的增 强子。
[0017] 三、斑马鱼神经组织特异性增强子的应用
[0018] ①研制神经组织特异表达荧光的转基因鱼，可用于神经器官再生过程研究；
[0019] ②用于驱动任意目的基因在神经组织特异表达，为研究者研究神经系统发育及相 关疾病治疗提供有力工具。
[0020] 与以往的增强子捕获研究相比，本发明具有下列优点和积极效果：
[0021] ①获得一种神经组织特异表达的转基因鱼，并发现该荧光特异标记斑马鱼眼睛 MUllerglia细胞，可用于斑马鱼眼睛发育及损伤再生过程的研究。
[0022] ②首次获得表达在神经组织的增强子基因序列，该序列可用于驱动包括报告基因 在内的任意目的序列在神经系统中特异表达，从而有助于研究特定基因在神经系统发育及 调控方面的作用，为相关疾病治疗提供新材料。
【附图说明】
[0023] 图1是神经组织特异绿色荧光蛋白表达模式分析图，
[0024] 激光共聚焦显微观察及整体原位杂交数据显示绿色荧光蛋白表达在端脑和嗅板 (A、D)，前脑、中脑、后脑、脊髓以及眼睛部位等组织器官中（B、C、E、F、G、H、I、J)。
[0025] 图2是荧光表达细胞类型检测图，
[0026] 对pTME12品系鱼48hpf至72hpf胚胎切片分析结果，A、B显示绿色荧光蛋白表达 在斑马鱼神经系统中类似放射状胶质细胞（RadialGlia)，C、D显示EGFP标记眼睛视网膜 中的Milllerglia细胞类型。
[0027] 图3是基因组插入位点分析图，
[0028]A-增强子捕获载体基因组插入位点示意图；
[0029] B-右侧完整性分析，所用引物位置如A所示；
[0030] C一左侧完整性分析，所用引物位置如A所示。
[0031] 图4是增强子序列分析图，
[0032] 通过电子预测，获得4个高度保守的非编码元件，分别命名为CNE1、CNE2、CNE3和 CNE4〇
[0033] 图5是增强子活性分析图，
[0034] A-增强子活性测试载体示意图；
[0035] B-增强子活性分析：a、b是pTME12转基因斑马鱼品系中观察到的EGFP表达模 式；c、d是CNE2增强子驱动报告基因的表达模式，与pTME12转基因斑马鱼品系一致，即在 中脑、后脑和脊索特异表达；e、f?是整体原位杂交的结果。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图和实施例对本发明详细说明：
[0037] 实施例中的实验方法，按常规条件进行，参考如萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南 (第二版，1992年，科学出版社）中所述实验方法。
[0038] 实施例1、增强子捕获载体的构建：
[0039] ①设计引物，从pmMREdl2mtlLUC3质粒中扩增mMTl最小启动子元件，所需引物序 列：
[0040] 上游引物：5' -ATAITCGTACGACTCGTCCAACGACTATAA-3'（NO. 3);
[0041] 下游引物：5 ' -CGGGGTACCGGTGAAGCTGGAGCTACG-3 '（NO. 4)。
[0042] ②以pmMREdl2mtlLUC3质粒为模板，用上述引物，扩增出105bp的片段，PCR循环 条件：94￡€51^11;94 1€308,601€308,721€308,30个循环；72°(：10111111，？〇?扩增产物经 1 %琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。
[0043] ③上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶BsiWI及KpnI进行酶切，与经 过相同酶切的PEFla-EGFP载体大片段连接，转化大肠杆菌ToplO'感受态细胞，用氨苄青霉 素仏111?)-1^平板筛选得到阳性菌落，经过酶切鉴定，得到？11111'146??-8611? 〇174中间载 体；然后采用BsiWI和BbuI分别双酶切pmMTl-EGFP-BGHPolyA和En-Trap载体，并对酶切 产物进行连接，得到pmMTl-enhancertrap载体。
[0044] ④设计引物，从pmMTl-enhancertrap质粒上扩增增强子捕获核心元件，所用引物 序列如下：
[0045] 上游引物：5' -CCGGAAITCTTCAGCCGATGATGAAAITG-3'（NO. 5);
[0046] 下游引物：5 ' -CATGCTTAGCCTGCCCCAGCTGGITCTITCCG-3 '（NO. 6)。
[0047] ⑤以pmMTl-enhancertrap质粒为模板，用上述引物，扩增出1204bp的长片段， ?〇?循环条件：94￡€51^11 ;941€308,601€308,721€2111111308,30个循环 ；72°(：10111111; PCR扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳试剂盒回收。
[0048] ⑥上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶EcoRI及Bpull02I进行双酶 切，与经过相同酶切的pminiTol2-genebreaking载体大片段连接，转化大肠杆菌ToplO' 感受态细胞，用氨苄青霉素（Amp)-LB平板筛选得到阳性菌落，经过酶切鉴定，得到增强子 捕获载体pminiTol2/SA-Exon-mMTl-EGFP-BGHPolyA，我们简写为pTMEo
[0049] 实施例2、斑马鱼饲养与转基因显微注射
[0050] ①斑马鱼饲养：斑马鱼（Daniorerio)，AB品系，饲养条件28°C，12h光照/12h黑 夜。
[0051] ②合成Tol2 转座酶cappedmRNA
[0052] A、线性化：用BamHI酶切线性化转录所用载体；
[0053]B、采用BioFluxDNA凝胶回收试剂盒回收线性化模板，DEPC水溶解线性化模板；
[0054]C、转录：采用成熟mRNA合成试剂盒里的T7转录酶（Ambion,FosterCity,CA)进 行转录，转录体系如下所示：
[0055]
[0056]将上述组分混匀后，37°C，转录2h ;
[0057]D、取IyL电泳检测后，加入0?5yL2U/yLDnaseI，37°C15min;
[0058] E、加入 57. 5ULNucleare-free water和 7. 5ULNH4AC终止反应；
[0059]F、等体积苯酸氯仿/氯仿抽提，等体积异丙醇沉