猪圆环病毒2型cap抗原制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及病毒抗原制备技术领域，具体涉及猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（PCV)首次发现于1974年，Tischer等人从污染的猪肾细胞系 PK-15(ATTC-CCL33)中分离到一种类似圆环病毒的新病毒，定名为猪圆环病毒（PCV)。血清 学调查表明，猪圆环病毒抗体在猪群中长期存在，但没有相关证据表明何种疾病是该病毒 感染引发的。因此，在当时人们认为该病毒是非致病性的。一年之后，北美和欧洲在断奶仔 猪多系统衰竭综合征（post-weaningmultisystemicwastingsyndrome,PMffS)患病猪身 上提取的组织中分离出类似猪圆环病毒的病原体。人们将最初无致病性的猪圆环病毒和与 PMffS爆发有关的新发现的分离病毒进行比较，发现这两个病原体在基因结构和抗原性上均 有不同。因此，猪圆环病毒被分为两个亚型：从PK-15细胞系中分离出的无致病性的病毒被 命名为猪圆环病毒1型（PCVl);从患病猪身上分离出的猪圆环病毒被命名为猪圆环病毒2 型（PCV2)。目前，流行病学调查显示，PCV2已经在世界范围内广泛分布，规模化养殖场几乎 没有血清阴性的猪。自PMffS首次在加拿大爆发至今，全世界五大洲均诊断出PMffS的感染， 对大多数养猪国造成了极大的威胁。
[0003]PCV2是目前已知的最小的病毒之一，其基因组是一条共价闭合的单链DNA，近似 于I. 76kb~I. 77kb。一般认为PCV2 有 11 个开放阅读框（openreadingframes，ORFs)， 然而仅有三个开放阅读框被认为可以编码蛋白。其中0RF2又称为CAP基因，位于互补链 上，呈逆时针方向，负责编码唯一的结构蛋白CAP，其氨基酸长度为233aa~234aa。CAP蛋 白也是PCV2的主要抗原，能诱导中和抗体的产生。
[0004] 由于防治PCV2的重要性，有关PCV2疫苗的制备成为生物制品研发的热点之一。 现有技术的PCV2疫苗主要是灭活疫苗和弱毒疫苗，但由于PCV2在体外细胞中培养难度 大，增殖力弱，导致现有技术的PCV2疫苗存在滴度较低，成本较高的缺陷。另一方面，PCV2 亚单位基因工程疫苗则有效克服了灭活疫苗和减毒活疫苗的上述缺陷，它是通过原核或 真核表达系统表达PCV2的结构蛋白CAP，再以此来制备PCV2的病毒样颗粒（Viruslike particles,VLP)，该VLP不含有病毒核酸，却具有与病毒相似的衣壳结构，能够作为抗原诱 导机体免疫应答，进而产生抗体。然而，现有技术中PCV2的CAP蛋白表达效率较低，这一 方面是由于表达系统本身不适于CAP蛋白表达基因的表达，另一方面也反应出CAP蛋白表 达基因与现有技术的表达系统不能较好的契合，这严重影响了抗原的产量及后续疫苗的制 备。
[0005] 那么如何针对CAP蛋白表达基因自身特点获取一套适宜的表达系统和配套的工 艺方法，同时实现CAP蛋白表达基因与表达系统的高效契合，将成为提升抗原制备效率的 关键。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪圆环病毒2型CAP抗原制备方 法，以解决现有技术中猪圆环病毒2型CAP抗原表达水平较低的技术问题。
[0007] 本发明要解决的另一技术问题是现有技术的猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法操 作繁琐的技术问题。
[0008] 本发明要解决的再一技术问题是由于现有技术的猪圆环病毒2型CAP抗原制备方 法，所制备的CAP蛋白难以形成病毒样颗粒，因此免疫原性较差的技术问题。
[0009] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 猪圆环病毒2型CAP抗原制备方法，该方法是将猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基 因整合到质粒上得到重组质粒，而后将所述重组质粒利用杆状病毒表达系统表达猪圆环病 毒2型CAP蛋白。
[0011] 优选的，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因是在猪圆环病毒2型CAP蛋白天 然表达基因基础上，以杆状病毒偏嗜密码子替换其中的杆状病毒非偏嗜密码子所修饰后的 基因；在此基础上进一步优选的，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因，其核苷酸序列如 SEQIDNOl所示。在该优选技术方案中，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因，是指 自然条件下野生型猪圆环病毒2型的CAP蛋白表达基因；所述的修饰，是指对基因的改造， 这种改造行为应当保证改造前和改造后所表达的蛋白氨基酸序列不变。
[0012] 优选的，所述杆状病毒表达系统是flashBAC杆状病毒表达系统。在该优选技术方 案中，所述flashBAC杆状病毒表达系统专指由英国OxfordExpressionTechnologies公 司（0ET公司）出品的型号为"flashBAC"的杆状病毒表达系统。
[0013] 优选的，所述杆状病毒表达系统以sf9昆虫细胞作为宿主细胞。
[0014] 优选的，所述质粒是杆状病毒转移载体P0ET3。
[0015] 优选的，所述猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因是利用BamHI和XhoI双酶切方法 获得的；在此基础上进一步优选的，是先将猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因克隆至pUC57 载体，而后再利用BamHI和XhoI双酶切方法得到大量的猪圆环病毒2型CAP蛋白表达基因。
[0016] 优选的，将目的基因克隆至杆状病毒转移载体p0ET3得到重组质粒后，将所述重 组质粒利用脂质体转染法导入宿主细胞表达猪圆环病毒2型CAP蛋白。
[0017] 优选的，将重组质粒利用杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型CAP蛋白后，取宿 主细胞培养液上清反复冻融，而后通过60~80KD菲托滤板去除细胞碎片，再通过4~6KD 滤膜浓缩，再离心浓缩，即得到所述猪圆环病毒2型CAP抗原；在此基础上进一步优选的， 所述离心浓缩是先以80000~120000g的速度超速离心，取沉淀，重悬，而后以20~40% 蔗糖密度梯度、130000~170000g的速度超速离心，取中间层即得到所述猪圆环病毒2型 CAP抗原。该技术方案还可以执行以下优选：所述冻融是反复冻融3次；所述菲托滤板的孔 径为70KD;所述滤膜的孔径为5KD;所述离心浓缩是先以1000 OOg的速度超速离心2h，取沉 淀，重悬，而后以20~40%蔗糖密度梯度、150000g的速度超速离心3h，取中间层即得到所 述猪圆环病毒2型CAP抗原。
[0018] 优选的，得到重组质粒后，先将该重组质粒转化至大肠杆菌中，利用大肠杆菌复制 该重组质粒，再将复制后的重组质粒利用杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型CAP蛋白； 更优的，所述大肠杆菌是大肠杆菌DH5a。
[0019] 本发明充分利用了杆状病毒表达系统对外源基因克隆容量大、重组病毒易于筛 选、翻译后加工修饰系统完备和表达外源基因能力强等技术特点，显著提升了猪圆环病毒2 型CAP蛋白的表达效率，尤其是当采用重组表达基因时，仍能保持较好的CAP蛋白表达效 果。而f IashBAC杆状病毒表达系统作为全新的重组杆状病毒表达平台，与传统的表达系统 比较，省略了繁琐的空斑筛选过程，一步法获得重组病毒。不仅省时省力，并且具有更高的 蛋白表达水平、活性和稳定性，尤其适用于难以表达的蛋白。
[0020] 此外，为了进一步提升表达效果，本发明在猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因 基础上依据杆状病毒表达系统对密码子的偏爱性进行了基因修饰，从而显著提升了重组表 达基因在杆状病毒表达系统中的表达效率。
[0021] 在此基础上，本发明针对杆状病毒表达系统以及CAP蛋白自身特点匹配了适宜 的纯化条件，该纯化方法一方面具有较高的纯度的收率，而且电镜观察发现以此纯化的产 物能够顺利形成猪圆环病毒2型的病毒样颗粒（VLP)，从而有效保证了免疫原性，为后续 PCV2VLP亚单位基因工程疫苗的研制奠定了良好的基础。本发明以严谨的技术构思实现了 突出的技术效果，同时成本可控、重现性好，因此具备优越规模化应用前景。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明实施例中猪圆环病毒2型CAP蛋白天然表达基因与修饰后的基因核 苷酸序列对照图；图中，Optimized字样代表修饰后的基因序列，Original字样代表猪圆环 病毒2型CAP蛋白天然表达基因序列，二者序列存在差异的部分通过阴影表示。
[0023] 图2是本发明实施例中重组杆状病毒p0ET3-CAP的PCR结果；图中，M为DNA分子 质量标准，1为PCV2全基因扩增产物，2为重组杆状病毒p0ET3-CAP上清扩增产物，3为重组 杆状病毒P0ET3-CAP沉淀扩增产物，4为sf9细胞扩增产物，5为ddH20扩增产物。
[0024] 图3是本发明实施例中表达产物的SDS-PAGE鉴定结果；图中M为蛋白质分子质量 标准，1为重组杆状病毒P0ET3-CAP上清，2为重组杆状病毒p0ET3-CAP沉淀，3为空白细胞。
[0025] 图4是本发明实施例中表达产物的Western-Blot鉴定结果；图中M为蛋白质分子 质量标准，1为重组杆状病毒P0ET3-CAP上清，2为重组杆状病毒p0ET3-CAP沉淀，3为空白 细胞。
[0026] 图5本发明实施例中表达产物的间接免疫荧光鉴定图；图中，A为重组杆状病毒 P0ET3-CAP感染sf9细胞48h (200 X)，B为正常sf9细胞培养120h (200 X)。
[0027] 图6是本发明实施例制备的PCV2VLPS的透射电镜图。
【具体实施方式】
[0028] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
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