鸭坦布苏病毒e蛋白第三结构域原核表达的方法及其应用
【专利说明】
[0001]技术领域:
本发明涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达的方法及其应用，属于生物基因工程领域。
[0002]【背景技术】:
鸭源坦布苏病毒病毒Tembusu κ/τ?Λ?, ZOT/Z/K)属黄病毒科黄病毒属成员，是引起国内以卵巢炎为特征的水禽新发传染性疾病的主要病原，该病流行广泛、传播迅速、自2010年首次报道以来，病毒已在产蛋鸭、肉鸭和鹅等养殖水禽上发生感染，并造成产蛋严重下降等经济损失。
[0003]DTMUV病毒编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中囊膜糖蛋白(envelopeprotein,简称E蛋白)是坦布苏病毒的主要结构蛋白，位于成熟病毒粒子表面，构成病毒颗粒的突起，在靶细胞受体结合，膜融合和病毒侵入过程中起着关键作用。具备较好的免疫原性和反应原性，是宿主抗感染免疫的主要保护性抗原，也是检测该病毒特异性抗体的理想革巴抗原O
[0004]
【发明内容】
:
本发明所要解决的技术问题是提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白原核表达的方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
本发明的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域原核表达的方法，包括下列步骤:
(1)特异性引物引物设计与合成: mmN-BainHl -F (上游引物)P1:
5，— GGA^(XTAGTGAAGAATCCTACCG— 3，黑体部分为添加的BamHl酶切位点；
DTMUV- EcoR 1-R (下游引物)P2:
5，— AAGTGAA77<3VCCCCCAACTGAGCC— 3，黑体部分为添加的及I酶切位点；
(2)鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆测序
(3)鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆表达
(4)重组质粒pET-28a-EM的表达与纯化
所述的鸭坦布苏病毒E蛋白的第三结构域的克隆测序是:
病毒RNA的提取按照病毒总RNA提取试剂盒的说明进行操作，RT-PCR反应体系按照PrimeScript? One Step RT-PCR Kit 说明进行操作，反应程序:50°C 30 min ；94°C 2 min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 45s，30个循环；72°C 10 min。反应结束后0.8%琼脂糖凝胶电泳检测电泳条带，胶回收试剂盒回收纯化PCR产物。将回收的PCR产物送往大连宝生物工程有限公司进行测序鉴定。
所述的鸭坦布苏病毒E蛋白第三结构域的克隆表达是:
以DTMUV-QD株病毒RNA为模板，E基因第三结构域的特异性引物进行RT-PCR扩增，连接转化按照《分子克隆实验指南》进行操作，构建重组表达质粒pET-28a-EM，并通过BamH\和EcoR\进行双酶切鉴定及序列分析。
[0006]所述的第三结构域重组质粒pET-28 a-EM的表达与纯化是: 重组质粒pET-28a-EM转化至大肠杆菌BL21 (Rosetta)感受态细胞，37°C过夜培养，挑选单个菌落至2 X YT培养基中，37 °C震荡培养过夜，按1: 100进行转种2 X YT培养基中，37°C振摇培养，用终浓度为0.1 mM的IPTG进行诱导表达。
[0007]将表达菌离心后加入PBS重悬菌体，超声波冰浴裂解，离心处理后的进行SDS-PAGE鉴定，通过N1-NTA亲和层析柱纯化重组E蛋白。
[0008]本发明的方法中表达的鸭坦布苏病毒E蛋白可用于检测鸭坦布苏病毒和制备鸭坦布苏病毒抗体。
[0009]本发明的有益效果:
坦布苏病毒是在我国首次发现的对水禽致病的新型黄病毒，传播迅速、对鸭鹅危害大，已给中国水禽业造成巨大的经济损失，由于坦布苏病毒在中国爆发时间短，所以在该病毒的致病机理、跨物种传播机制及疫苗研制方面还存在很多迫切需要解决的难题。E蛋白是黄病毒的囊膜蛋白，也是主要的结构蛋白，同时研究结果表明，E蛋白是体外中和作用的主要靶点和病毒特异性抗体的作用位点，具有中和活性，能够刺激机体产生抗体引发特异性免疫。对E蛋白进行X射线晶体研究表明:第3结构域具备类免疫球蛋白样结构域，包含病毒结合受体。具备组成主要线性表位的区域，也包含病毒中和单抗的识别位点。
[0010]本发明所构建的pET-28a-EM重组质粒经IPTG诱导可表达出分子量约20KD的E基因第三结构域重组蛋白，Western blotting分析该融合蛋白与DTMUV阳性血清反应呈阳性。具备良好的抗原性，可为建立ELISA方法、免疫荧光、免疫组化以及单克隆抗体的制备等提供原材料。
[0011]【附图说明】:
图1是DTMUV E蛋白氨基酸序列的⑶D分析结果。
[0012]图2是DTMUV E蛋白的抗原性指数分析。
[0013]图3 是 pet28a_EM 重组质粒双酶切鉴定。Ml: λ -Η?η? III DNA Marker ；M2:DL2000 ；1:pET28a-EM/ BamHl + EcoRI ；2: DTMUV-E recombinant plasmid。
[0014]图 4 是表达蛋白的 SDS-PAGE 鉴定。M: Protein Mff marker (Broad) ;1:未加 IPTG诱导的沉淀；2:未加IPTG诱导的上；3:未加IPTG诱导的全蛋白；4:1PTG诱导的沉淀；5:1PTG诱导的上清；6:1PTG诱导的全蛋白。
[0015]图5是重组6蛋白纯化产物的SDS-PAGE分析。M.蛋白质分子量；1.1PTG诱导的菌液；2.N1-NTA亲和层析柱洗脱峰(含有纯化的重组EM蛋白)。
[0016]图 6 是表达蛋白的 SDS-PAGE 鉴定。M:Prot1n marker ；1:pET-28-E inducedby IPTG ；2:pET-28_E uninduced by IPTG ；3:The western blotting of the proteinsinduced by IPTG ；4:The western blotting of the proteins uninduced by IPTG0
[0017]【具体实施方式】:
实施例1鸭坦布苏病毒E基因第三结构域的原核表达
I材料和方法
1.1毒株、菌株与质粒
DTMUV QD株由本实验室分离并保存。E.coli DH5 α菌株、Rosetta(DE3)菌株及原核表达载体pET28a ( + )由本室制备并保存；BKH细胞、骨髓瘤细胞SP2/0由本实验室保存；
1.2试剂 M-MLV反转录酶、Razoal RNA提取试剂盒购自Promega公司；Ex Taq DNA扩增用酶，IPTG、DNA marker和限制性内切酶及碰和EcoR\均购自大连宝生物工程有限公司；DNA片段凝胶快速回收试剂盒以及质粒提取试剂盒购自Tiangen公司；6XHis蛋白质纯化树脂N1-NTA购自QIAGEN公司；羊抗鸭HRP-1gG、羊抗鼠HRP-1gG购自Jackson公司；羊抗鼠FITC-1gG、PEG4000、HAT等购自Sigma公司；BALB/c购自山东大学实验动物中心。自然感染的康复鸭源DTMUV多抗由本实验室分离保存。
[0018]主要生物信息学分析工具
应用NCBI Conserved Domains查找工具分析氨基酸序列保守结构域，应用DNAStarProtean软件模块进行抗原指数预测，用Emini原则预测特定区域位于蛋白质表面的可能性，应用亲水性、表面特性、柔韧性和二级结构4种参数联合的Jameson-Wolf法综合预测蛋白的抗原指数，并根据各结构域的抗原指数结果选取主要抗原域iMain antigenicdomains, MAD)命名为 E-M。
[0019]引物的设计与合成
根据DTMUV QD株基因序列(GenBank登录号HQ833330.1)，设计一对E基因第三结构域的特异性引物，预扩增片段长度345bp，由大连宝生物合成。
[0020]mmN-BarnHl -F (上游引物)P1:
5’ — GGA^(XTAGTGAAGAATCCTACCG— 3，黑体部分为添加的及碰们酶切位点 DTMUV- EcoRl