一种利用重组大肠杆菌发酵生产多佐胺中间体的方法
【技术领域】
[0001] -种利用重组大肠杆菌发酵生产多佐胺中间体的方法，属于微生物基因工程领 域。本发明还涉及一种多佐胺中间体的制备，该化合物可以用来制备治疗青光眼用药多佐 胺。
【背景技术】
[0002] 青光眼是一类以特异性视神经损害和视野缺损为特征的眼病，是目前主要的、不 可逆性的致盲眼病之一。而多佐胺是一种局部眼用碳酸酐酶抑制剂，广泛用于高眼压症、青 光眼等，全身性不良反应少。多佐胺由美国默克公司自主研发，是第一个获美国FDA批准的 首只碳酸酐酶抑制剂，于1995年在美国上市。
[0003]多佐胺（Dorzolamide):由默沙东公司开发商品名"舒净霹"（Trusopt)，FDA于 1994年12月批准的首只眼用CAI，适用于P-受体阻滞剂治疗无效的原发性开角型青光眼 和剥脱综合征继发性青光眼。本品于1998年1月8日在中国获行政保护，已于2005年7 月8日终止，但目前尚未进口，亦无国内企业生产及申报。多佐胺结构见附图1:
[0004] 多佐胺的化学合成中涉及到手性中间体的合成，而常规的合成路线选择性不明 显，且手性化合物合成成本较高，因此导致终产品的成本升高；而有的合成路线经过改良， 缩减了反应步骤，操作简单，但反应产品的构型几乎都是不需要的顺式异构体。因此，有必 要需找一条更加经济、高效的制备方法。
【发明内容】
[0005] 针对目前化学合成法获得多佐胺成本高，污染大，提取率低的缺陷，本发明要解决 的问题是提供一种利用重组大肠杆菌发酵生产多佐胺关键中间体的方法。
[0006] 本发明通过将经密码子优化后的乙醇脱氢酶基因连接商业化的表达载体上，在大 肠杆菌中过量表达该乙醇脱氢酶，以多佐胺中间体^s)-甲基酮砜为底物，催化产生多佐 胺的手性中间体。
[0007] 本发明所述的一种利用重组大肠杆菌发酵生产多佐胺手性中间体的方法，其特征 在于，所述的重组大肠杆菌由如下方法构建：利用公布的乙醇脱氢酶的基因序列，按照大肠 杆菌偏爱的密码子进行突变，通过引入酶切序列，将全基因合成并引入pET_28a表达质粒 上，构建了可表达乙醇脱氢酶的重组质粒pET-mADH将所构建的重组质粒pET-mADH转化至 大肠杆菌中，得到过量表达乙醇脱氢酶基因的重组大肠杆菌。
[0008] 其中，所述的乙醇脱氢酶结构基因来源于来源于粗糙脉胞菌（Neurospora crassa)〇
[0009] 上述表达乙醇脱氢酶基因的载体为pet_28a，该质粒来源于Novagen公司。
[0010] 本发明所述重组大肠杆菌的构建步骤：
[0011] 1?乙醇脱氢酶基因的优化
[0012] 基本方法是根据粗糙脉胞菌（Neurosporacrassa)的乙醇脱氢酶基因，通过优化 乙醇脱氢酶的密码子，消除一些低使用率的密码子，同时通过同义转换，优化mRNA的一级 结构，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。并利用同义转化方法消除NdeI和 XhoI酶切位点。通过个全基因合成，合成乙醇脱氢酶基因。
[0013] 2.乙醇脱氢酶基因表达载体的构建
[0014] 基本方法是通过全基因合成的方法合成优化后的乙醇脱氢酶基因，然后根据设计 的酶切位点，将乙醇脱氢酶基因片段连接到pET-28a质粒上，构建重组质粒pET-mADH。
[0015] 3.乙醇脱氢酶重组表达菌株的构建
[0016] 基本方法是将所构建的重组质pET-mADH转化至大肠杆菌中，从而获得过量表达 乙醇脱氢酶的重组大肠杆菌。
[0017] 本发明所述重组大肠杆菌在生产多佐胺中间体中的应用，具体方法是：
[0018] 挑取重组大肠杆菌单菌落接种到LB液体培养基（含氨苄青霉素50iig/mL)中， 37°〇、200印111过夜培养后，按2%接种量接入2501^摇瓶完全培养基（1%胰蛋白胨，0.5%酵 母抽提物，1%NaCl，pH7. 0-7. 2)，在旋转式摇床中30°C、200rpm培养24h。超声破菌，离心 收集酶液，在PH4. 0,以^S)-甲基酮砜为底物，催化产生多佐胺的手性中间体。
【附图说明】
[0019] 附图1多佐胺的结构式
[0020] 附图2pET-mADH的结构示意图
[0021] 附图3纯化后的乙醇脱氢酶HPLC图
【具体实施方式】
[0022] -般性说明：实施例所涉及的酶均购自promega公司，质粒提取试剂盒与琼脂糖 凝胶回收试剂盒均购自omega公司，操作完全按照相应说明进行。全基因合成由上海生工 公司完成。
[0023]LB培养基（％):1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1%NaCl，pH7.0_7.2。
[0024] 1^11抗性平板：1%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1%似(]，卡纳青霉素5〇1^/1]11。
[0025] SOC培养基（用于感受态细胞的复苏）：2% (W/V)胰蛋白胨，0? 5%(W/V)酵母抽 提物，0? 05% (W/V)NaCl, 2. 5mMKCl，10mMMgC12,20mM葡萄糖。
[0026] 5XKCM(大肠杆菌转化缓冲液）：0? 5MKC1, 0? 15MCaC12, 0? 25MMgCL20
[0027] 实施例I:脯氨酸-4-羟化酶基因序列的设计
[0028] 根据大肠菌杆的密码子使用频率来优化基因密码子，消除低使用率的密码子，同 时利用同义转化方法消除NdeI和XhoI酶切位点，故将原始序列中的并将终止子修改为 TAAT强终止子，为了便于将乙醇脱氢酶基因连接到其他质粒载体上，因此在终止子后面插 入一个酶切位点XhoI(CTCGAG)。
[0029] 本实施方式中乙醇脱氢酶基因序列的原始序列，见GenbankAccession号 3873329。本实施方式中优化的乙醇脱氢酶基因序列提交给上海生工公司人工合成；优化的 乙醇脱氢酶基因序列见SEQIDNO:1。
[0030] 实施例2 :乙醇脱氢酶基因基因表达载体及重组大肠杆菌的构建
[0031] 将全合成的乙醇脱氢酶基因基因用限制性内切酶NdeI和XhoI酶双酶切，同时， 将质粒载体pet-28a也分别用NdeI和XhoI酶双酶切。将双切酶后的乙醇脱氢酶基因基 因以及pET-28a质粒载体用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后用T4DNA连接酶将三个基因片段 连接起来。连接体系为10PL:
[0032] 乙醇脱氢酶基因：5 ii L
[0033]pet_28a质粒：1UL
[0034]IOXbuffer：1. 0 U L
[0035]T4DNAligase：2UL
[0036] 无菌水补充至10UL，16°C连接过夜后，将5iiL的连接液转化至大肠杆菌BL21感 受态细胞中，转化过程为：将5iiL连接液加入至50iiL的DH5a感受态细胞中，然后再加入 10yL的5XKCM缓冲液，混匀后，在冰上放置30min后，42°C热激90s，然后在冰上放置5min 后，加入500iiL的SOC培养基，37°C，200rpm培养60min后，涂布至Kan抗性平板上，培养 12h后，提取质粒进行验证。然后进一步测序验证基因序列是否正确。从而得到了构建好 的pET-mADH重组质粒，质粒图谱如说明书附图2，同时获得重组大肠杆菌BL21/pET-mADH， 纯化后的乙醇脱氢酶的纯度高达99%，见附图3。
[0037] 实施例3:重组菌株的发酵实验
[0038] 挑取重组大肠杆菌单菌落接种到LB液体培养基（舍氨苄青霉素50iig/mL)中， 37°C、200rpm过夜培养后，按2 %接种量接入250mL摇瓶完全培养基（1 %胰蛋白胨，0. 5 % 酵母抽提物，1%NaCl，pH7. 0-7. 2)，在旋转式摇床中30°C、200rpm培养24h。超声破菌，离 心收集酶液，在PH4. 0,以20g(6S)_甲基酮砜为底物，催化产生多佐胺的手性中间体。发酵 16小时后过滤，滤液浓素至干，加入200毫升乙酸乙酯和100毫升水，搅拌、分液，水相乙酸 乙酯提取两次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，浓缩至干，得到白色固体，固体用乙酸乙酯重 结晶，得到13. 6g中间体，收率68 %。
【主权项】
1. 优化后的乙醇脱氢酶基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ IDNO. 1所示。2. -株重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： 将权利要求1所述的优化后的乙醇脱氢酶基因可操作的连接到表达载体上，构建得到 重组质粒；将重组质粒转化到宿主大肠杆菌中，得到产乙醇脱氢酶的重组菌。3. 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的表达载体为pET-28a质粒。4. 由权利要求2或3所述构建方法得到的重组大肠杆菌。5. 权利要求4所述的重组大肠杆菌在生产多佐胺中间体中的应用。6. 按照权利要求5所述的应用.，其特征在于，包括：将所述的重组大肠杆菌接种到培 养基中进行诱导培养；超声破碎，离心收集酶液，催化产生多佐胺的手性中间体。7. 按照权利要求6所述的应用，其特征在于：在pH4.0,以（6S)-甲基酮砜为底物的条 件下催化产生多佐胺的手性中间体。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，利用一种重组大肠杆菌发酵生产多佐胺中间体的方法，该重组大肠杆菌的构建方法如下：利用公布的乙醇脱氢酶的基因序列，按照大肠杆菌偏爱的密码子进行突变，通过引入酶切序列，将全基因合成并引入pET-28a表达质粒上，构建了可表达乙醇脱氢酶的重组质pET-mADH。本发明所述的大肠杆菌产生的重组乙醇脱氢酶可通过底物催化合成多佐胺的中间体，摇瓶发酵表明，本发明的重组大肠杆菌的乙醇脱氢酶的表达量达到0.53g/L，说明该工程菌具有良好的工业开发前景。
【IPC分类】C12N15/53, C12R1/19, C12N15/70, C12N1/21, C12P17/18
【公开号】CN105087608
【申请号】CN201410186709
【发明人】陈建华
【申请人】陈建华
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年5月6日