黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物工程技术领域，尤其涉及的是一种黄酮醇多位点葡萄糖基转 移酶CSUGT73A20基因及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 植物中的黄酮类物质，属于苯并啦喃环结构的一类天然化合物。它们多在苯并口比 喃环母核的3-0, 5-0, 7-0, 3'-0,4'-0等多羟基位点上与糖基团结合形成黄酮苷类物质。茶 树中的黄酮类主要为柚皮素（N)、山奈素（KC)，山奈酚（K)和芹菜素（A)，如图1所示。
[0003] 黄酮及黄酮苷类物质是茶叶多酚的重要组成成分，不仅是茶汤中涩味等品质成 分物质，也是构成汤色色泽的重要因子。茶树黄酮及其苷类具有多种生理功能如抗氧化 等，是当今药物和保健品热门开发的对象。
[0004] 黄酮醇糖基化在很多植物中主要发生在3或7-OH上，但是，在2004年Lim关于拟 南芥糖基转移酶的研究中发现，一些糖基转移酶没有严格区域选择性，可以在槲皮素的3、 7、3'，或4'位点糖苷化，在某些情况下，甚至形成少量的3, 7二槲皮素糖苷和7, 3'二槲 皮素糖苷。而对山奈酚非特异性糖基化的研究只在2008年Markus的报道中发现：FaGT6 和FaGT7糖基转移酶基因主要形成3-0-山奈酚葡萄糖糖苷，少量的7-0-山奈酚葡萄糖糖 苷和4'-0_山奈酚葡萄糖糖苷。并且FaGT6糖基转移酶基因还能形成少量的一种二葡萄糖 糖苷。而对茶树中CsUGT73A20糖基转移酶基因研究发现它不仅可以形成多位点山奈酚单 葡萄糖糖苷，还可以非特异性形成多种多位点山奈酚二葡萄糖糖苷（山奈酚3, 7-0-二葡萄 糖糖苷，山奈酚3,4' -0-二葡萄糖糖苷和山奈酚7, 3' -0-二葡萄糖糖苷），如图1所示。 随着反应时间延长，其中3, 7-0-二葡萄糖糖苷产量增加显著。迄今为止，茶树中编码依赖 尿苷二磷酸葡萄糖的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶基因的功能还没有得到验证。本发明研 究一种能编码尿苷二磷酸葡萄糖依赖的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶基因，构建重组工程 菌，提供一种生产多种黄酮醇葡萄糖苷的方法。
[0005] 柚皮素苷、山奈素苷、山奈酚苷和芹菜素苷都是黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶基 因的产物。有一些黄酮苷类物质如柚皮素苷、山奈素苷、部分山奈酚单糖苷可以商品化购 买。但是还有一些黄酮苷类物质，如山奈酚双氧葡萄糖苷，由于天然含量低纯化难度大，至 今没有市场商品产物。
【发明内容】
[0006] (一）解决的技术问题
[0007] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇多位点 葡萄糖基转移酶CSUGT73A20基因及其编码蛋白和应用，以提供一种新的能够编码茶树黄 酮醇多位点葡萄糖基转移酶基因及其编码蛋白。利用本发明的重组工程菌，可以大量合成 山奈酚双氧葡萄糖苷，为山奈酚双氧葡萄糖苷等多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷生物合成的 工程化奠定基础。
[0008] (二）技术方案
[0009] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
[0010] -种黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因，该基因具有如SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列。
[0011] 优选的，所述的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CSUGT73A20基因应用于多位点黄 酮醇单糖苷及双糖苷生物合成。
[0012] -种黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因的编码蛋白，所述编码蛋白 具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
[0013] 优选的，所述的编码蛋白应用于多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷生物合成。
[0014] 一种重组质粒，所述重组质粒含有所述黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CSUGT73A20 基因，具有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
[0015] 优选的，所述重组质粒为将黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因连接 到pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT73A20。
[0016] -种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有所述的重组质粒，或其基因组中整合 有外源的所述的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因序列，具有如SEQ ID NO :1 所示的核苷酸序列。
[0017] 优选的，所述转基因工程菌为含有所述重组质粒的大肠杆菌Novablue (DE3)菌 株，或其基因组中整合有所述黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因序列的大肠 杆菌Novablue (DE3)菌株。
[0018] (三）有益效果
[0019] 本发明提供了一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇多位点葡萄糖基转移酶 CsUGT73A20基因及其编码蛋白和应用，首次克隆并验证了形成多位点黄酮醇单糖苷及双糖 苷相关的黄酮醇葡萄糖基转移酶CsUGT73A20基因功能，本发明还提供了含有CsUGT73A20 基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成多位点黄酮醇 单糖苷及双糖苷，进一步开展多位点黄酮醇单糖苷及双糖苷的生物合成调控研究奠定基 础。
【附图说明】
[0020] 图1是类黄酮物质（柚皮素、山奈素，山奈酚和芹菜素）及其部分葡糖糖糖苷物质 的化学结构式。
[0021] 图2是CsUGT73A20重组蛋白（rCsUGT73A20)的SDS-PAGE蛋白电泳分析图;其中， M为蛋白Marker;1为重组质粒诱导前；2为重组质粒诱导后；3为诱导后破碎后上清；4为 诱导后破碎后沉淀；5为纯化后蛋白。
[0022] 图3是HPLC分析rCsUGT73A20催化的酶活产物结果图，其中，图3-A~3-F以 UDP-葡萄糖为糖供体，以黄酮醇化合物（山奈酸，山奈酚3-0-葡萄糖苷，山奈酚7-0-葡萄 糖苷，山奈素，芹菜素，柚皮素）作为糖受体的HPLC图谱；
[0023] 图4是重组CsUGT73A20蛋白催化合成黄酮醇葡萄糖苷产物的一级质谱和二级质 谱分析图谱；其中，图4-A~4-F为山奈酚双氧葡萄糖苷，山奈酚葡萄糖苷，山奈素双氧葡萄 糖苷，山奈素葡萄糖苷，芹菜素葡萄糖苷，柚皮素葡萄糖苷的一级和二级质谱图；
[0024] 图5为pMal_c2X质粒图谱
【具体实施方式】
[0025] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 以及实施例附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实 施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0026] 一、材料
[0027] 1、茶树品种：舒茶早（Camelliasinensis(L. )0?Kuntze.var.sinensiscultivar Shuchazao)，采集茶树鲜叶，迅速用液氮冷冻，储存于_80°C冰箱中备用；
[0028] 2、pMal_c2X载体；
[0029] 3、大肠杆菌Novablue(DE3)表达宿主菌：购于上海北诺生物科技有限公司；
[0030] 4、LB培养基：称取IOg的NaCl，5g的酵母提取物，IOg的胰蛋白胨，加入950mL去 超纯水搅拌溶解，用lmol/L的NaOH调pH至7. 0,加水定容至lOOOmL，高压蒸汽灭菌15min， 即获得LB液体培养基，LB固体培养基为在LB液体培养基中加入15g的琼脂粉即可；
[0031] 5、质量比为40%的葡萄糖溶液：称取40g葡萄糖，加入超纯水溶解搅拌均匀，定容 至IOOmL，110°C灭菌IOmin;
[0032] 6、氨节青霉素母液（Amp+，lOOmg/mL):称取Ig氨节青霉素Amp，溶于IOmL灭菌水， 过滤除菌，分装小管，_20°C保存；
[0033] 7、lmol/L的IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷）：称取2. 383gIPTG，溶于灭菌 超纯水，定容至10mL，过滤除菌，分装并于-20°C保存；
[0034] 8、蛋白纯化缓冲液：上柱缓冲液：称取0? 37gEDTA，11. 67gNaCl，2. 42gTris， 0. 15gDTT于足量纯水中，搅拌使其充分混匀。用稀盐酸调其PH至7. 4,定容至1L，即得上 柱缓冲液。洗脱缓冲液：IL上柱缓冲液中加入3. 60g麦芽糖，溶解搅拌均匀。
[0035] 9、IOOmM的pH7. 5的Tris-HCL缓冲溶液：称取I. 1214gTris加水至90mL搅拌溶 解均匀，加稀HCL调pH至7. 5,补水定容至IOOmL;
[0036] 10、体积比为1 %的乙酸：用移液管量取IOmL色谱级乙酸溶液于IL容量瓶中，用 超纯水定容至1L。
[0037] 二、CsUGI73A20 基因的克隆：
[0038] 1、设计带有表达载体pMal_c2X载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列 如SEQIDNO:3 和SEQIDNO:4 所示：
[0039] SEQIDNO:3 :正向引物：5' -
[0040] CGCGGATCCATGGGTAAGCTTAAATTCTTCTTC-3 '
[0041] SEQIDNO:4 :反向引物：5' -
[0042] ACGCGTCGACTTATGAACTCAATTCTTGTATTAG-3' ；
[0043] 2、按照TaKaRaRNAiso试剂盒和RNAisoPlus试剂盒说明书，提取茶树