黄酮醇7-O-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种黄酮醇7位葡萄糖基转移酶基因 CsUGT75L12及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002] 黄酮类化合物是构成茶叶品质及功能成分的特征性物质，是影响茶叶滋味、汤色 的重要因素。是自然界普遍存在的一类低分子量的多酚化合物，黄酮类化合物是由苯丙 氨盐途径合成，根据黄酮类化合物中心C环的不同修饰，可分为黄酮、黄酮醇、黄烷醇、异黄 酮、黄烷酮和花青素等几大类。表1分别列举了一些常见的黄酮、黄酮醇和花青素的化合物 及其结构。
[0003] 黄酮类化合物是药用植物的主要活性成分之一，如抗突变，抗糖尿病，抗菌，消炎， 降血压，抗紫外线，控制体重以及帕金斯病的防治等，还有保护肝脏、抑制癌细胞增生、增加 血液的抗氧化活性等药效，是新药研发的活性先导物的来源宝库。但是，天然存在的黄酮类 化合物往往具有水溶性差、稳定性不好、作用靶点多、选择性较差、药效不好等缺点，给适应 性新药的寻找与开发还来了相当大的困难。进而进行化学修饰研究，是新药研制的一条有 效途径之一。
[0004] 经过糖苷化修饰后的黄酮类化合物，以黄酮糖苷的形式存在于植物体内，糖苷化 修饰后的化合物，可作为一种活化的中间体参与到其它代谢途径。糖苷化是对黄酮类化合 物进行化学修饰的有效途径之一，它可改善黄酮类化合物的水溶性、稳定性、选择性，提高 黄酮类化合物的药效。
[0005] 黄酮醇-7-0葡萄糖基转移酶，是一种依赖于尿苷二磷酸糖（UDPG)的糖基转移酶 (UDP-glycosyltransferases，UGTs)。它能专一性的催化黄酮类化合物在A环的第7位轻 基糖苷化，高效的形成黄酮-7-0葡萄糖苷单糖苷，（图1)。目前C环3位羟基糖苷化已经 在茶树，葡萄等植物中被鉴定，在大豆、葛根等植物中也发现异黄酮7-0葡萄糖转移酶的存 在，它能够催化异黄酮A环的第7位羟基发生糖苷化，迄今为止，茶树中编码尿苷二磷酸葡 萄糖依赖的黄酮醇7-0葡萄糖基转移酶的基因还没有得到验证。
【发明内容】
[0006] (一）解决的技术问题
[0007] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种从茶树鲜叶中分离获得的黄酮醇 7-0-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因，通过构建重组工程菌，得到重组蛋白，借助于酶反 应方法，利用基因工程菌的重组蛋白作为催化酶，得到转化率为85. 2%的高效转化生成山 奈酚7-0-葡萄糖苷的反应条件。验证了茶树中编码尿苷二磷酸葡萄糖依赖的黄酮醇7-0 葡萄糖基转移酶的基因。
[0008] (二）技术方案
[0009] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
[0010] 一种黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶CSUGT75L12基因，该基因具有如SEQIDN0:1 所示的核苷酸序列。
[0011] 优选的，所述黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶CSUGT75L12基因应用于黄酮醇第七位 羟基发生糖苷化，所述黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因应用于单糖苷生物合 成。
[0012] -种黄酮醇7-0-葡萄糖基转移CsUGT75L12基因的编码蛋白，所述编码蛋白具有 如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
[0013] -种重组质粒，所述重组质粒含有所述黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12 基因SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
[0014] -种重组质粒的构建方法，将黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因连接 到pMal-c2X载体的多克隆位点中构建获得，命名为pMal-c2X-CsUGT75L12。
[0015] -种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有所述重组质粒，或其基因组中整合有 所述的黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因核苷酸序列，具有如SEQIDNO:1所 示的核苷酸序列。
[0016] 优选的，所述转基因工程菌为含有所述重组质粒的大肠杆菌Novablue (DE3)菌 株，或其基因组中整合有所述的黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因核苷酸序列 的大肠杆菌Novablue (DE3)菌株。
[0017] -种重组蛋白，所述重组蛋白为含有所述的黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶 CsUGT75L12基因的编码蛋白，具有如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。
[0018] 优选的，所述重组蛋白作为催化酶，通过建立最适酶反应条件，得到黄酮醇 7-0-葡萄糖苷。
[0019] 优选的，所述最适酶反应条件为：反应体系PH为8. 5~9. 5,反应温度为30~ 37°C，反应时间为35~42min，酶加入量为0~25ug。
[0020] (三）有益效果
[0021] 本发明提供了一种黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶CsUGT75L12基因及其编码蛋白和 应用，首次克隆并验证了黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶基因CsUGT75L12功能，本发明还提供 了含有CsUGT75L12基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白，提供一种利用工程菌生产 黄酮醇-7-0葡萄糖苷的方法。本发明与传统的分离提取、化学合成等方法比较而言，本方 法的优点在于原料简单易得，方法简单，生产成本低，试剂用量少，产率高达85. 2%等优势。 本发明为实现黄酮醇7-0糖苷商品化生产提供了代谢工程基础。
【附图说明】
[0022] 图1为黄酮醇7-0-葡萄糖基转移酶的催化流程图与化学结构式，以山奈酚为糖 受体，UDP-葡萄糖为糖供体，经过rCsUGT75L12催化生成山奈酚7-0-葡萄糖苷和UDP。
[0023] 图2为CsUGT75L12重组蛋白（rCsUGT75L12)的SDS-PAGE蛋白电泳分析图；其中， M为蛋白Marker;1为重组质粒诱导前；2为重组质粒诱导后；3为诱导后破碎后上清；4为 诱导后破碎后沉淀；5为纯化后蛋白。
[0024] 图3为HPLC分析rCsUGT75L12催化的酶活产物结果图，其中，图3-A~3-C以 UDP-葡萄糖为糖供体，以黄酮醇化合物（山奈酚，芹菜素和柚皮素）作为糖受体的HPLC图 谱；
[0025] 图4为重组CsUGT75L12蛋白催化合成黄酮醇7-0-葡萄糖苷产物的一级质谱和二 级质谱分析图谱；其中，图4-A~4-C分别是山奈酚7-0-葡萄糖苷，芹菜素7-0-葡萄糖苷 和柚皮素7-0-葡萄糖苷的一级质谱和二级质谱分析图谱；
[0026] 图5为反应在不同的酶反应条件下的HPLC图谱，A-C分别代表了酶反应的不同条 件。
[0027] 图6为pMal_c2X质粒图谱
【具体实施方式】
[0028] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 及实施例附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术 人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未 注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。其中几种常见的黄酮和黄酮类化合 物及结构式如表1所示。
[0029] 表1几种常见的黄酮和黄酮醇类化合物及结构式
[0030]
[0031] 一、材料
[0032] 1、茶树品种：农抗早（Camelliasinensis(L.)0?Kuntze.var.sinensiscultivar Nongkangzao)，采集茶树鲜叶，迅速用液氮冷冻，储存于-80°C冰箱中备用；
[0033] 2、pMal_c2X载体，其中pMal_c2X质粒图谱如图6所示；
[0034] 3、大肠杆菌Novablue (DE3)表达宿主菌：购于上海北诺生物科技有限公司；
[0035] 4、LB培养基：称取IOg的NaCl，5g的酵母提取物，IOg的胰蛋白胨，加入950mL去 超纯水搅拌溶解，用lmol/L的NaOH调pH至7.0,加水定容至lOOOmL，高压蒸汽灭菌15min， 即获得LB液体培养基，LB固体培养基为在LB液体培养基中加入15g的琼脂粉即可；
[0036] 5、质量比为40%的葡萄糖溶液：称取40g葡萄糖，加入超纯水溶解搅拌均匀，定容 至IOOmL，110°C灭菌IOmin;
[0037] 6、氨节青霉素母液（Amp+，lOOmg/mL):称取Ig氨节青霉素Amp，溶于IOmL灭菌水， 过滤除菌，分装小管，-20°C保存；
[0038] 7、lmol/L的IPTG(异丙基硫代-f3 -D-半乳糖苷）：称取2. 383gIPTG，溶于灭菌 超纯水，定容至10mL，过滤除菌，分装并于-20°C保存；
[0039] 8、蛋白纯化缓冲液：上柱缓冲液：称取0?37gEDTA，11. 67gNaCl，2. 42gTris， 0. 15gDTT于足量纯水中，搅拌使其充分混匀。用稀盐酸调其PH至7. 4,定容至1L，即得上 柱缓冲液。洗脱缓冲液：IL上柱缓冲液中加入3. 60g麦芽糖，溶解搅拌均匀。
[0040] 9、IOOmM的pH7. 5的Tris-HCL缓冲溶液：称取I. 1214gTris加水至90mL搅拌溶 解均匀，加稀HCL调pH至7. 5,补水定容至IOOmL ;
[0041] 10、体积比为1 %的乙酸：用移液管量取IOmL色谱级乙酸溶液于IL容量瓶中，用 超纯水定容至1L。
[0042]二、CsUGI75L12基因的克隆：
[0043]1、设计带有表达载体pMal_c2X载体的多克隆酶切位点的特异引物，其引物序列 如SEQIDNO:3 和SEQIDNO:4 所示：
[0044] SEQ ID NO :3:正向引物：5' -TCTAGAATGCAAGCGGAGAAAGCTAGGC-3'
[0045]SEQIDNO:4 :反向引物：5' -CTGCAGCTATAAGCAATCTCCTCCAACC-3' ；
[0046] 2、按照TaKaRaRNAiso试剂盒和RNAisoPlus试剂盒说明书，提取茶树品种农抗 早鲜叶RNA，并反转录为cDNA;
[0047] 3、以反转录产物cDNA为模板，用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4引物进行扩增，扩 增程序为94°C预变性30s，94°C变性10s，62°C退火20s，72°C延伸50s，30个循环，72°C继续 延伸10min，获得的PCR产物置于16°C保存。
[0048] 4、将PCR产物利用PCR纯化试剂盒纯化，并连接到pMD19-TSimpleVector后进 行菌落PCR验证，获得阳性菌落，提取菌落质粒，获得含有CsUGT75L12基因的T载体，同时 将菌液送至深圳华大公司进行测序。
[0049] 三、CsUGI75L12基因的原核表达及功能验证
[0050] 本实施例中所用到的原核表达和及其功能验证技术手段为本领域的普通技术人