一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物病毒基因工程技术领域。具体涉及一种猪圆环病毒2型Cap蛋白 表达载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪2型圆环病毒（Porcinecircovirus，PCV-2)被认为是猪断奶后多系统衰竭综 合征（PMffS)，增生性坏死性肺炎（PNP)、猪皮肤与肾病综合征（PDNS)、猪呼吸系统疾病综合 征（PRDC)、繁殖障碍、先天性震颤及肠炎等疾病的主要病原，统称猪2型圆环病毒相关疾 病，而且PCV-2感染引起免疫抑制，极易导致其它病原混合感染或继发感染，是目前严重危 害养猪业的病原之一。在我国，目前几乎100%猪场为猪2型圆环病毒阳性。
[0003] 目前，国内外都有商品化的猪圆环病毒2型疫苗，主要分为3种。第1种是亚单位 疫苗，主要表达PCV-2的0RF2蛋白作为免疫原，再加上合适的疫苗佐剂配制疫苗；其代表性 的产品包括勃林格殷格翰的CircoFlex疫苗。第2种是嵌合病毒灭活疫苗，即用PCV-2的 0RF2基因置换PCV-I的0RF2基因，然后用构建的嵌合病毒制备灭活疫苗；其代表性的产品 为富道公司的Suvaxyn疫苗。第3种是全病毒灭活疫苗，梅里亚公司出品的Circovace疫 苗和国产圆环疫苗均属于此类。
[0004] 目前在国内的市售疫苗主要为国产灭活疫苗与勃林格殷格翰的CircoFlex。而国 产疫苗由于为全病毒灭活疫苗，病毒增殖滴度低，生产成本高，导致不仅价格高，而且免疫 效果不理想。而勃林格殷格翰采用杆状表达主要的免疫原性Cap蛋白，不仅抗原含量高，副 反应小，但是价格昂贵。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒2型Cap蛋白 表达载体，以便利用廉价的大肠杆菌高效表达猪圆环病毒的Cap蛋白亚单位抗原，显著降 低抗原生产成本，简化生产工艺，为养猪业提供物美价廉的疫苗产品。
[0006] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] -种猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体是猪圆环病毒2型0RF2基因经过优化 后得到的优化密码子克隆至pET_28a载体中所获得的表达载体。
[0008] 进一步的，本发明所述的优化密码子的核苷酸序列为SEQIDNO. 1所示。
[0009] 本发明的第二个目的在于提供一种圆环病毒2型Cap蛋白表达载体的构建方法， 通过该方法获得一种能高效表达猪圆环病毒的Cap蛋白亚单位抗原的蛋白表达载体。
[0010] -种猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体的构建方法，该构建方法包括以下步 骤：
[0011] 1)获取猪圆环病毒2型0RF2序列；
[0012] 2)对0RF2序列的进行密码子优化：根据大肠杆菌中密码子的使用频率，对0RF2 序列的密码子进行优化，得到优化密码子；
[0013] 3)PCR扩增：以上述优化密码子为模板使用叠加PCR方法进行全基因扩增；
[0014] 4)构建表达载体：将pET_28a用NcoI与XhoI双酶切，然后将步骤3)的扩增产 物克隆至NcoI与XhoI位点之间，得到目的产物，目的产物经NcoI与XhoI双酶切鉴定， 表达载体构建完成。
[0015] 进一步的，本发明步骤2)所得到的优化密码子序列为SEQIDNO. 1所示。
[0016] 进一步的，本发明步骤3)PCR扩增中所用的引物如下：
[0017] 上游引物由 5' 端向 3' 端序列为：CATGCCATGGGCACCTACCCGCGCCGTCGIT;
[0018] 下游引物 5' 端向 3' 端序列为：GTGCTCGAGTTACGGGITCAGCGGCGGATCTITC。
[0019] 进一步的，本发明步骤4)经NcoI与XhoI双酶切鉴定步骤为：回收目的产物的 目的条带，连接后转化DH5a，用卡那霉素LB平板筛选，挑取阳性菌落用含卡那霉素LB培养 液培养，抽提质粒，用NcoI/XhoI双酶切鉴定。
[0020] 本发明的第三个目的在于提供圆环病毒2型Cap蛋白表达载体用于检测免疫答应 效应。
[0021] 本发明所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体用于表达猪圆环病毒2型Cap 蛋白。
[0022] 本发明的第四个目的在于提供利用本发明的表达载体表达猪圆环病毒2型Cap蛋 白的方法，该方法包括以下步骤：
[0023] 1)诱导表达：将表达载体转化大肠杆菌中，用卡那霉素LB平板筛选，获得阳性菌 株，挑取阳性菌落接种含卡那霉素LB培养液，震荡培养至少12h，然后经扩大培养、震荡培 养4h后将温度降低至25~30°C，加入IPTG诱导培养，离心收集菌体加入裂解液重悬菌体， 用高压均质机破碎菌体，离心收集上清，用SDS-PAGE鉴定表达载体表达情况；
[0024] 2)猪圆环病毒2型Cap蛋白的纯化，按照以下步骤进行：
[0025] a)将高压均质机破碎后的菌体离心上清，使用50%饱和度硫酸铵进行分级沉淀， 离心收获沉淀；
[0026] b)用PBS缓冲液溶解，离心弃去沉淀；
[0027]c)上清加入5%曲拉通X-114,冰上混合后转移至37°C的水浴保持30分钟；
[0028] d)待溶液浑浊后，高速离心使溶液分层，小心转移水相，弃曲拉通有机相；
[0029] e)重复步骤c)、d)直到内毒素小于50EU/ml，SDS-PAGE确定猪圆环病毒2型Cap 蛋白浓度。
[0030] 本发明的第五个目的在于提供猪圆环病毒2型Cap蛋白在制备抗猪圆环病毒2型 Cap蛋白疫苗中的应用。
[0031] 本发明还提供了一种猪圆环病毒2型Cap蛋白疫苗，包括抗原和佐剂，所述抗原为 本发明所获得的猪圆环病毒2型Cap蛋白，猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原和佐剂的体积比 为4 : 1，猪圆环病毒2型Cap蛋白抗原的浓度为30yg/mL-40iig/mL。
[0032] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明能够构建出高效表达猪2型圆环 病毒主要免疫原性蛋白Cap蛋白的原核表达载体，并通过利用大肠杆菌进行高效表达出猪 2型圆环病毒Cap蛋白，显著降低抗原生产成本，简化生产工艺，为养猪业提供物美价廉的 疫苗产品。
[0033] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0034] 图1为PCV-20RF2基因片段PCR扩增电泳图，其中M:DNA分子质量标准；1 : PCV-20RF2基因PCR扩增产物；
[0035] 图2为pShac3转化感受态大肠杆菌BL21 (DE3)后诱导表达，其中M:蛋白分子量 标准；1 :诱导后全菌；2 :诱导后裂解细胞上清；
[0036] 图3为重组Cap蛋白纯化前与纯化后比较，其中Marker:DNA分子质量标准。
【具体实施方式】
[0037] 本发明所述的猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体，该表达载体是猪圆环病毒2 型0RF2基因经过优化后得到的优化密码子克隆至pET-28a载体中所获得的表达载体。
[0038] 进一步的，本发明所述的优化密码子的核苷酸序列为SEQIDNO. 1所示。
[0039] 本发明的第二个目的在于提供一种圆环病毒2型Cap蛋白表达载体的构建方法， 通过该方法获得一种能高效表达猪圆环病毒的Cap蛋白亚单位抗原的蛋白表达载体。
[0040] -种猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达载体的构建方法，该构建方法包括以下步 骤：
[0041] 1)获取猪圆环病毒2型0RF2序列；
[0042] 2)对0RF2序列的进行密码子优化：根据大肠杆菌中密码子的使用频率，对0RF2 序列的密码子进行优化，得到优化密码子；
[0043] 3)PCR扩增：以上述优化密码子为模板使用叠加PCR方法进行全基因扩增；
[0044] 4)构建表达载体：将pET_28a用NcoI与XhoI双酶切，然后将步骤3)的扩增产 物克隆至NcoI与XhoI位点之间，得到目的产物，目的产物经NcoI与XhoI双酶切鉴定， 表达载体构建完成。
[0045] 进一步的，本发明步骤2)所得到的优化密码子序列为SEQIDNO. 1所示。
[0046] 进一步的，本发明步骤3)PCR扩增中所用的引物如下：
[0047] 上游引物由 5' 端向 3' 端序列为：CATGCCATGGGCACCTACCCGCGCCGTCGIT;
[0048] 下游引物 5' 端向 3'