一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法

文档序号:9367770阅读:1148来源:国知局
一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域,具体涉及一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合 物的方法。
【背景技术】
[0002] Nrf2蛋白是细胞内的一种转录因子,控制基因的表达。Nrf2在细胞受到外界有 害刺激后被激活,激活的Nrf2增加多种细胞内保护因子的基因表达水平,产生细胞保护效 应,抑制细胞的损伤。
[0003] 利用小分子化合物(药物)作为Nrf2的激活剂,在没有外界有害刺激的情况下通 过药物作用激活Nrf2,起到细胞保护作用,是目前新药研发的一个方向。目前国外开发的小 分子Nrf2激活剂有些已经进入临床研究阶段。
[0004] 在新药开发的前期阶段,需要从众多的化合物中筛选具有Nrf2激活作用的化合 物。目前常用的研究方法包括:
[0005] (1)用分子生物学方法检测Nrf2靶基因的表达水平(如:TanKP,YangM,Ito S:Activationofnuclearfactor(erythroid-2like)factor2bytoxicbileacids provokesadaptivedefenseresponsestoenhancecellsurvivalattheemergence ofoxidativestress.MolPharmacol2007, 72 (5) :1380-1390.)D 主要缺点:实验步骤复 杂,无法满足高通量(高效率)筛选的需要;结果随机误差大。
[0006] (2)用生物化学方法检测Nrf2靶基因(主要是NAD(P)H:醌氧化还原 酶-1)的功能活性(如:Dinkova-KostovaAT,LibyKT,StephensonKK,Holtzclaw WD,GaoX,SuhN,WilliamsC,RisingsongR,HondaT,GribbleGffetal:Extremely potenttriterpenoidinducersofthephase2response:correlationsof protectionagainstoxidantandinflammatorystress.ProcNatlAcadSciUSA 2005, 102(12) :4584-4589.)。主要缺点:实验结果不能直接反映Nrf2的功能活性,特异性 较差;较难实现高通量筛选。
[0007] (3)用生物化学的方法检测Nrf2蛋白在细胞中的积累水平(如:Wondrak GTjCabelloCM,VilleneuveNFjZhangS,LeyS,LiY,SunZ,ZhangDD:Cinnamoyl-based Nrf2-activatorstargetinghumanskincellphoto-oxidativestress.FreeRadic BiolMed2008, 45(4) :385-395.)。主要缺点:无法满足高通量筛选的需要D
[0008] (4)在细胞中瞬时表达带有Nrf2结合位点的报告基因,检测Nrf2增强基因表达 的功能水平(WondrakGT,CabelloCM,VilleneuveNF,ZhangS,LeyS,LiY,SunZ,Zhang DD:Cinnamoyl-basedNrf2-activatorstargetinghumanskincellphoto-oxidative stress.FreeRadicBiolMed2008,45(4):385-395.)。此方法与其他方法相比主要的优 点是检测数据能够直接反映Nrf2的转录因子功能活性。主要缺点:无法满足高通量筛选的 需要D

【发明内容】

[0009] 本发明的目的就是提供一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法。
[0010] 为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
[0011] -种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法,步骤如下:
[0012] (1)构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因;
[0013] ⑵将报告基因插入到pGL4. 26[luc2/minP/Hygro]质粒当中,得到报告基因质 粒;
[0014] (3)用大肠杆菌(或感受态DH5a菌株)将报告基因质粒扩增并提纯质粒;
[0015] (4)用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞。
[0016] 稳定转染后是否能得到反应性良好的细胞株取决于所用的报告基因DNA序列,所 用的质粒系统和所用的细胞之间的组合效果,最终的结果无法预测,只能通过实验确定最 终产品是否可用。本发明用pGL4. 26[luc2/minP/Hygro]质粒和HeLa细胞搭配制备得到的 稳定表达细胞株,经过用已知的Nrf2激活物刺激细胞和用Nrf2基因沉默(抑制原有Nrf2 的活性)正反两种方法,均证实具有能满足试验需要的敏感性和特异性。
[0017] 所述步骤⑷中还包括用已知的Nrf2激活剂鉴定各细胞株的反应性,选取反应性 良好(即:药物Sulforaphane或Tert-butylhydroquinone诱导的Luciferase活性与对照 (相应浓度的药物溶剂,如DMS0)处理相比增加2倍以上)的细胞株。
[0018] 上述的方法在新药研发中的应用。
[0019] 上述的方法筛选得到的化合物,所述的化合物在制备具有Nrf2激活活性药物中 的应用
[0020] 本发明的有益效果:
[0021] 高通量是制药企业研发所需要的,稳定转染后是否能得到反应性良好的细胞株取 决于所用的报告基因DNA序列和所用的细胞之间的组合效果,最终结果无法预测,只能通 过实验摸索,这是成功与否的难点之一。
[0022] 本发明改进了原有的检测Nrf2激活作用的方法,使其能够适应新药前期开发阶 段高通量筛选的需求。原有方法完成一次检测通常需要半天到两天不等,而一次实验所能 检测的样品数量不超过十几个。使用本发明的方法,每个96孔板可检测至少10个样品,完 成一个96孔板检测的时间少于30分钟。
[0023] 本发明采用新一代的含抗生素抗性基因的质粒系统,不但克服了无法进行稳定转 染的缺陷,而且新一代质粒在报告基因末端增加了转录增强子元件,更加优化了在哺乳动 物细胞中表达的敏感性和特异性。高通量检测技术是以分子水平和细胞水平的实验方法为 基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测 仪器采集实验结果数据,以计算机分析处理实验数据,在短时间内检测数以千万的样品,并 以得到的相应数据库支持运转的技术体系,它具有微量、快速、灵敏和准确等特点,是当今 制药企业在新药研发初始阶段必不可少的工具。针对不同的生物分子靶点或不同类别的化 合物,必须有现成的分子水平和细胞水平的实验方法才能完成筛选工作,我们的方法即是 建立了针对"Nrf2"的分子水平和细胞水平的实验方法,是针对Nrf2为生物靶点的新药研 制高通量筛选流程的基础。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明流程图;
[0025] 图2为HygromycinB筛选后光镜下见到的稳定表达细胞克隆的形态。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0027] 如图1所示,一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法,包括以下步 骤:
[0028] (1)人工构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因
[0029] (i)人工合成单链DNA片段I(78个碱基);序列如SEQIDNo. 1,
[0030] 5 'CCCAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCCAGTCACAGTGACTCAGCAGAATCCAGTCACAGTGACT CAGCAGAATCGTAA3'
[0031] (ii)人工合成单链DNA片段II(86个碱基);序列如SEQIDNo. 2,
[0032]
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