转gfp基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及PEG介导的原生质体转化技术领域，具体涉及转GFP基因的高粱靶斑 病菌突变体的转化方法。
【背景技术】
[0002] 高粱革E斑病的病原菌为平脐懦孢菌（BipolarisSorghicola)，病菌的分生孢子微 弯，两端钝圆，有3-7个横隔膜，分生孢子脐点明显可见且与基部边缘平齐。在自然界中，该 病菌以菌丝体和分生孢子在土壤或高粱秸杆上越冬；翌年条件适宜时，分生孢子萌发形成 附着胞，从叶表皮侵入寄主；病菌在寄主内扩展并可形成新的分生孢子从寄主表皮细胞间 生出，孢子再借风雨传播反复侵染。自1939年高粱靶斑病被首次报道以来，其后又在塞浦 路斯、印度和菲律宾等高粱产区相继发现。目前，该病已经成为高粱的主要叶部病害之一， 严重时可造成高粱减产高达50%。平脐蠕孢菌除了能对高粱致病外，还是其他多种作物病害 的病原菌，如水稻胡麻叶斑病、小麦根腐病和玉米小斑病等。
[0003]-般的植物病原菌在接触寄主表面后，接受不同的胞外信号，并通过环腺苷酸、丝 分裂原激活蛋白激酶以及Ca2+等物质介导的信号转导途径来调控附着胞的分化和发育， 并通过附着胞来侵入寄主细胞。在平脐蠕孢菌中，已经有一些信号转导途径相关基因的功 能得到鉴定。Moriwaki等在水稻平脐蠕孢菌中发现了一个MAPK途径的编码基因SRM1，该 基因对活性氧、过氧化氢及紫外线胁迫具有重要作用。随后，他们又发现了一个对该病原菌 的致病性有重要作用的MPK途径编码基因BMKl。该基因缺失突变体的菌丝生长速率与野 生型相比明显下降，且无法产生分生孢子，并最终导致致病性完全丧失。Ste7是玉米大斑 病菌的一个MAPK编码基因，该基因对其菌丝生长无明显影响，但是在无性和有性繁殖方面 具有重要作用。无法产生子囊壳导致有性生殖过程受阻，且菌丝形成的分生孢子功能不完 整，无法产生附着胞，导致致病性下降。Izumitsu等研究发现玉米小班病菌的MAPKKK编码 基因ChStell能够通过影响分生孢子的萌发、黑色素的合成及附着胞的形成导致致病性降 低。
[0004]高粱靶斑病菌的基因功能和致病性研究还鲜有报道，本文通过PEG介导的原生质 体转化技术成功将GFP质粒转入到高粱靶斑病菌中，并成功获得了转GFP基因的突变体。 该体系的建立可为高粱靶斑病菌的致病基因研究提供帮助，进而为揭示其致病机制奠定基 础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法，它建立了 PEG介导的高粱靶斑病菌原生质体转化体系，为了研究高粱靶斑病菌的基因功能并为揭示 其致病机制奠定基础。
[0006]为了解决【背景技术】所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它的转化方法： 步骤一：材料准备 首先获得GFP质粒、高粱靶斑病菌菌株；PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉 15g;TB3培养基：酵母抽提物3g，酪蛋白氨基酸3g，蔗糖20%，琼脂7. 5g; 步骤二：高粱祀斑病菌原生质体制备与转化 取5mmXIOmm的菌丝块，切碎后置于PDA液体培养基中，28°C，160r/min，黑暗下振荡 培养2d;过滤菌丝，将菌丝置于含细胞壁裂解酶的0. 7MNaCl中，30°C，60r/min振荡培养 6h以上；过滤上述液体并分装于2ml的离心管中，6000r离心5min;弃上清，加入Iml0. 7M NaCl，悬浮原生质体，6000r离心5min;弃上清，加入适量0. 7MNaCl，镜检观察原生质体数 量，加入IOWGFP质粒，室温静置20min;加入ImlPEG，室温静置20min;将上述液体倒入 IOml管中，并加入5ml液体再生培养基，28°C，60r/min过夜振荡培养；倒板：将过夜培养 的原生质体倒入50°C左右的固体再生培养基(含博莱霉素）中；覆盖：晾干后，再用约50°C 的再生培养基覆盖一层(博莱霉素浓度为倒板时的2倍）;待转化子长出培养基后，挑于PDA 板上，并用PCR和荧光鉴定突变体。
[0007] 本发明的有益效果：它建立了PEG介导的高粱靶斑病菌原生质体转化体系，为了 研究高粱靶斑病菌的基因功能并为揭示其致病机制奠定基础。
【附图说明】 图1为本发明中具体实施例中PEG浓度对高粱靶斑病菌原生质体转化效率的影响的对 比图。
【具体实施方式】
[0008] 实施例： I. 1质粒与菌株 GFP质粒由某农业大学张教授惠赠，高粱靶斑病菌菌株为本实验室保存。
[0009] 1. 2培养基 PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g; TB3培养基：酵母抽提物3g，酪蛋白氨基酸3g，蔗糖20%，琼脂7. 5g。
[0010] 1. 3博莱霉素对高粱靶斑病菌生长的影响 接种高粱靶斑病菌菌丝块于含不同浓度的博莱霉素PDA板上，28°C，黑暗培养5d，观察 菌落生长情况，博莱霉素的浓度分别为0、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L。
[0011] 1.4高粱靶斑病菌原生质体制备与转化 取5mmXIOmm的菌丝块，切碎后置于PDA液体培养基中，28°C，160r，黑暗培养2d;过滤 菌丝，将菌丝置于含细胞壁裂解酶的0. 7MNaCl中，30°C，60r，6h以上；过滤上述液体并分 装于2ml的离心管中，6000r离心5min;弃上清，加入Iml0. 7MNaCl，悬浮原生质体，6000r 离心5min;弃上清，加入适量0. 7MNaCl，镜检观察原生质体数量，加入IOWGFP质粒，室温 静置20min;加入ImlPEG，室温静置20min;将上述液体倒入IOml管中，并加入5ml液体再 生培养基，28°C，60r，过夜培养；倒板：将过夜培养的原生质体倒入50°C左右的固体再生培 养基(含博莱霉素）中；覆盖：晾干后，再用约50°C的再生培养基覆盖一层(博莱霉素浓度为 倒板时的2倍）；待转化子长出培养基后，挑于PDA板上，并用PCR和荧光鉴定突变体。
[0012] 1. 5高粱靶斑病菌原生质体转化条件研究 以I. 4所述实验方法为基础，通过单因素实验研究细胞壁裂解酶、PEG浓度和再生培养 基对高粱靶斑病菌原生质体制备和转化效率的影响 1. 5. 1细胞壁裂解酶。
[0013] 用融壁酶、蜗牛酶和崩溃酶3种酶共7种组合来酶解高粱靶斑病菌的细胞壁，将酶 溶解于30ml0.7MNaCl中，过滤除菌，加入菌丝后，酶解，镜检统计原生质体产量。
[0014] 1.5.2 PEG浓度。
[0015] 高粱靶斑病菌原生质体与GFP质粒混合后，分别用10%、20%、30%、40%和50%的卩￡6 介导原生质体的转化，分别统计转化子数量和转化效率。
[0016] 1. 5. 3再生培养基。
[0017] 在倒板和覆盖时，以PDA和TB3为再生培养基，观察转化子在再生培养基中的生长 速率。
[0018] 1. 6转化子的PCR检测与荧光观察 待转化子长出培养基表面后，挑取于含博莱霉素的PDA板上，4d后提取DNA，用于PCR检测，并用荧光显微镜观察转化子的荧光。
[0019] I. 7 GFP突变体致病性鉴定 将1. 6中鉴定得到的突变体进行致病性鉴定。菌丝块切碎置于PDA液体培养基中， 28°C，160r，黑暗培养ld，将菌丝球接种于离体的大麦叶片表面，28°C保湿培养，观察叶片的 发病情况。
[0020] 2. 1博莱霉素对高粱靶斑病菌生长的影响 本实验所用GFP质粒带有博莱霉素抗性，故在进行原生质体转化前，先观察博莱霉素 对高粱靶斑病菌生长的影响。博莱霉素浓度梯度为0、50mg/L、100mg/L、150mg/L和200mg/ L。当培养基中博莱霉素浓度为50mg/L时，即可对高粱靶斑病菌的菌丝生长有明显抑制。
[0021] 2. 2细胞壁裂解酶对高粱靶斑病菌原生质体制备的影响 本实验中用到的细胞壁裂解酶为融壁酶、蜗牛酶和崩溃酶，结果发现，在30ml0.7M NaCl中加入0. 3g融壁酶、0.Ig蜗牛酶和0.Ig崩溃酶，在30°C，60r，过夜酶解的条件下，获 得的原生质体量最多，可达到96个/W(表1)。而在同等条件下，融壁酶与崩溃酶酶解得 到的原生质体数量也能达到91个/>1，故本实验室采用该组合来酶解高粱靶斑病菌菌丝。
在PEG介导的遗传转化过程中，PEG浓度高低对转化效率具有重要作用。由图1可知， 当PEG浓度为20%时，获得的转化子个数最多，可达到16个/板，随着浓度的升高，转化子 个数明显下降。
[0023] 2. 4再生培养基对高粱靶斑病菌转化子生长的影响 以PDA和TB3为再生培养基，在28 °C黑暗条件下培养，结果发现TB3培养基中，3d即可 有转化子长出，而PDA培养基中，需要5d时间，说明TB3培养基更有利于高粱靶斑病菌转化 子的再生。
[0024] 2. 5转化子荧光鉴定 待转化子长出再生培养基后，挑取于含抗生素的PDA平板中，4d左右，取菌丝于荧光显 微镜下观察，以鉴定突变体。
[0025] 2. 6转GFP突变体致病性观察 取GFP突变体菌丝球接种于大麦叶片，观察突变体对大麦的侵染情况。突变体能够成 功侵染大面表皮细胞，说明该GFP突变体不影响高粱靶斑病菌的致病性，能够在其致病性 实验中应用。
【主权项】
1.转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法，其特征在于它的转化方法： 步骤一：材料准备 首先获得GFP质粒、高粱靶斑病菌菌株；PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉 15g ;TB3培养基：酵母抽提物3g，酪蛋白氨基酸3g，蔗糖20%，琼脂7. 5g ; 步骤二：高粱祀斑病菌原生质体制备与转化 取5mmX IOmm的菌丝块，切碎后置于PDA液体培养基中，28°C，160r/min，黑暗下振荡 培养2d ;过滤菌丝，将菌丝置于含细胞壁裂解酶的0. 7M NaCl中，30°C，60 r/min振荡培养 6h以上；过滤上述液体并分装于2ml的离心管中，6000r离心5min ;弃上清，加入1ml 0. 7M NaCl，悬浮原生质体，6000r离心5min ;弃上清，加入适量0. 7M NaCl，镜检观察原生质体数 量，加入IOW GFP质粒，室温静置20min ;加入1ml PEG，室温静置20min ;将上述液体倒入 IOml管中，并加入5ml液体再生培养基，28°C，60 r/min过夜振荡培养；倒板：将过夜培养 的原生质体倒入50°C左右的固体再生培养基(含博莱霉素）中；覆盖：晾干后，再用约50°C 的再生培养基覆盖一层(博莱霉素浓度为倒板时的2倍）;待转化子长出培养基后，挑于PDA 板上，并用PCR和荧光鉴定突变体。
【专利摘要】本发明涉及PEG介导的原生质体转化技术领域，具体涉及转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法。将高粱靶斑病菌菌丝置于30ml？0.7M？NaCl中（含融壁酶0.3g，崩溃酶0.1g），30℃，60r，黑暗条件下过夜裂解能够得到较多的原生质体，将GFP质粒与原生质体混合后用20%的PEG处理25min介导其转化并以TB3为再生培养基可以较快较多的获得转化子，最后经荧光和致病性鉴定，成功获得了转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体。它建立了PEG介导的高粱靶斑病菌原生质体转化体系，为了研究高粱靶斑病菌的基因功能并为揭示其致病机制奠定基础。
【IPC分类】C12N15/87, C12N1/15
【公开号】CN105087652
【申请号】CN201510377777
【发明人】郭士伟, 彭陈, 葛婷婷, 何晓兰
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月2日