一种可调控多酶级联反应用于合成光学纯烯丙型环氧酮或醇的制作方法
【专利说明】一种可调控多酶级联反应用于合成光学纯烯丙型环氧酮或 醇
[0001] 说明书
技术领域
[0002] 本发明属于微生物与酶工程技术领域，具体涉及了一种共表达羰基还原酶与苯乙 烯单加氧酶的重组大肠杆菌作为生物催化剂，催化a，P_不饱和酮合成光学纯烯丙型环氧 酮或醇的方法。
【背景技术】
[0003] 光学纯环氧化合物是最重要的有机合成砌块之一，与亲核试剂开环可以衍生出众 多的手性官能团。光学纯烯丙型环氧酮/醇是邻位带有羰基/羟基的特殊多官能团环氧化 合物，它既具备环氧化合物共同的性质，也具有羟基/羰基的特殊反应性。因此，它们具有 更为广泛的衍生性，通过官能团转化能够衍生出大量的手性官能团，是许多手性天然产物 和药物的合成前体，如：著名抗癌类药物紫杉醇PaclitaxeLl1S通道阻滞剂Diltiazem,受 体诘抗剂白三稀Leukotriene。
[0004]Weitz-SchefTer环氧化是最著名的方法，它利用H2O2作为催化剂，在强碱性环境 中催化a，0 -不饱和酮环氧化合成光学纯环氧酮。近年来，从Weitz-Scheffer环氧化已 衍生出多种缺电子烯烃不对称环氧化路线，并且针对不同底物表现出优异的转化率和立 体选择性，其中经典的有机催化制备手性环氧酮的方法包括：手性配体-金属过氧化物催 化环氧化、多聚氨基酸催化环氧化和相转移催化环氧化等。目前，尚无生物方法报道利用 a，P-不饱和酮不对称环氧化合成光学纯环氧酮。
[0005] 手性烯丙型环氧仲醇有2-3连个连续手性中心，目前，化学方法制备手性烯 丙型环氧醇只有动力学拆分1-苯基-2-丙烯醇这一个底物，转化率为51%，对映体 过量为93 %，其在-20 °C条件下反应时间长达12天才能完成（Zhang，W.Angewandte Chemie-InternationalEdition. 200544,4389-4391)。生物方法主要是通过动力学拆分消 旋体环氧醇类化合物来获得，Takeshita等人利用Lipase拆分消旋体环氧醇得到光学纯的 (1S，2R)_ 环氧酯，其ee值为 93% (Takeshita，M.etal.TetrahedronAsymmetry. 19923， 1369-1372) ;Lin等人报道了利用苯乙烯单加氧酶StyAB2动力学拆分消旋体a-取代丙烯 醇类化合物，其ee值最大为>99%，但是拆分过程中最大理论产率只有50%;拆分消旋体烯 丙基仲醇合成烯丙型环氧醇，转化率为12-50%，ee值为78-99%，非对映体过量30-99% (Lin,H.etal.ChemicalCommunications. 201147,2610-2612)〇
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种可调控多酶级联反应用于合成光学纯烯丙型环氧酮或 醇，具体说来，该方法是大肠杆菌重组菌E.coliBL21AnemA(PRSFD-REAB)为生物催化剂， a，P-不饱和酮为底物，利用异丙醇作为开关进行调控，从而生物催化合成光学纯烯丙型环 氧酮或醇。本发明的思路可以用说明书附图1表示。
[0007] 本发明所述的多酶级联反应合成光学纯烯丙型环氧酮或醇的方法为：
[0008] 反应体系：生物催化剂为重组菌E.coliBL21AnemA(pRSFD-REAB)全细胞，缓冲 液为磷酸盐缓冲液，底物为a，P-不饱和酮。该反应体系生成光学纯烯丙型环氧酮，底物到 产物的反应历程见说明书附图2。
[0009] 当向上述反应体系中加入异丙醇时，则产物为光学纯烯丙型环氧醇，底物到产物 的反应历程见说明书附图3。反应体系中异丙醇体积浓度为1-15%，v/v。
[0010] 上述底物a,P-不饱和酮包括4-苯基-3- 丁烯-2-酮或者该化合物在〇-/m-/ P-位的卤素或甲基取代的衍生物，以及4-(2-噻吩）-3- 丁烯-2-酮，4-(3-噻吩）-3- 丁 烯-2-酮，4- (3-萘）-3- 丁烯-2-酮。
[0011] 底物先溶解于二甲基亚砜中（底物贮存液浓度10%，w/v)，反应体系中底物终浓 度为 0.l-30mM。
[0012] 生物催化剂重组大肠杆菌细胞（以湿重计）为100-200g/l;磷酸盐缓冲液为磷酸 钾或者磷酸钠（〇. 1M，pH= 6. 0-8. 0);反应温度为25-40°C，反应震荡转速为150-250rpm， 反应时间为0. 5-5h。
[0013] 本发明所用生物催化剂大肠杆菌重组菌E.coliBL21AnemA(pRSFD-REAB)是通过 以下方法构建的：
[0014] ⑴利用人RED重组系统敲除大肠杆菌E.coliBL21基因组中N-乙酰马来酰亚胺 还原酶基因nemA，获得重组表达宿主菌E.coliBL21AnemAo
[0015] (2)将羰基还原酶READH和苯乙烯单加氧酶StyAB2共同连入双表达载体 pRSFDuet-lT(Novagen公司）上，获得双酶共表达质粒，命名为pRSFD-REAB。
[0016] (3)将质粒pRSFD-REAB转入表达宿主菌E. coli BL21 A nemA中，构建本发明所用 生物催化剂E. coli BL21 A nemA(pRSFD-REAB)〇
[0017] 上述重组菌的详细构建方案见实施例1。
[0018]幾基还原酶READH(NCBI登录号为AY161280)克隆自Rhodococcuserythropolis DSM43060(购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心），苯乙烯单加氧酶（StyAB2,NCBI登 录号为⑶593979)克隆自pseudomonassp.LQ26 (中国典型培养物保藏中心，CCTCCNO:M 2010188)。
[0019] 产物的检测方法：
[0020] 反应结束后，取Iml反应液，加入800 y 1乙酸乙酯萃取，12, OOOrpm离心2min，取 有机相，加入适量无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，Iml异丙醇溶解，有机滤膜过滤后HPLC检测。 采用Shimadzu Prominence LC-20AD system大赛璐手性色谱柱AD-H，检测器为PDA。检测 条件，异丙醇：正己烧=l〇:90,0. 5ml/min，柱温35°C。
[0021] 本发明的有益效果：本发明首次利用多酶级联反应实现了生物催化不对称环氧化 a，不饱和酮合成手性烯丙型环氧酮。同时，利用该级联反应，只需在反应体系中加入异 丙醇，就可实现合成光学纯烯丙型环氧醇。反应体系十分简单，操作容易，转化效率高，得到 的产物ee值和de值高，为光学纯烯丙型环氧酮/醇提供了高效的生物合成路线。
【附图说明】
[0022] 图I，本发明的思路简图。
[0023] 图2,光学纯烯丙醇环氧酮合成历程图。
[0024] 图3,光学纯烯丙醇环氧醇合成历程图。
[0025] 图4,模式底物4-苯基-3- 丁烯-2-酮转化生成产物的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法，需要指出的是，本实施例仅 用于解释本发明，而非对本发明范围的限制。
[0027]实施例 1:生物催化剂E.coliBL21AnemA(pRSFD-REAB)的构建
[0028] (1)大肠杆菌表达菌株E.coliBL21AnemA的构建方法
[0029] 由于E.coliBL21基因组中nemA基因表达的N-乙酰马来酰亚胺还原酶能够高效 还原底物a, (6-不饱和酮的C=C键，所以我们引入ARed重组，敲除E.coliBL21基因组 中nemA基因。
[0030] 分别以P1/P3，P4/P2为引物（表1)，以E.coliBL21基因组DNA为模板，分别扩增 出nemA基因两侧同源序列。PCR扩增条件：94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸0? 5min, 30个循环，72°C最后延伸lOmin。
[0031]以FRTf?和FRTr为引物（表I)，以质粒pKD4为模板，扩增出卡那霉素抗性基因片 段。PCR扩增时由于片段长度不同，72°C延伸1.5min，其余条件同上。
[0032] 利用引物P1/P2将上述三段DNA通过重叠PCR链接，制备成线性打靶DNA序列。 PCR扩增时由于片段长度不同，72°C延伸2min，其余条件同上。
[0033] 挑取E.coliBL21/pKD46 (含有质粒pKD46)单克隆接种于10mlLB培养基（氨苄 青霉素50yg/ml)，30°C、230rpm培养过夜。转接Iml培养液至100mlSOB培养基（氨苄青 霉素50yg/ml)，30°C、230rpm、2h，添加2mML-阿拉伯糖诱导，继续培养至0D62。= 7. 0时， 冰浴30min，离心（4°C，4, 500rpm) 10min，用预冷的10%甘油洗涤三次，浓缩至100y1，制成 电转化感受态细胞，冻于_80°C备用。
[0034] 取￡.(：〇118121/?1(046电转感受态细胞50^1与高浓度35^1(10^)同源重组片 段均勾混合。置于0.Icm预冷电击杯中，冰浴30min，1.8kV电击4_5ms。加入ImlSOB液体 复苏液（ImML-阿拉伯糖），37°C、复苏lh。将菌体全部涂布于LB平板（含卡那霉素50yg/ ml)上37°C培养24h，筛选重组子。待筛选平板上长出单克隆，用P5/P6进行菌落PCR，并测 序验证。
[0035] 将pCP20质粒转入重组子中，涂布于LB平板（含氨苄青霉素50yg/ml)，30°C，培 养过夜。从平板上挑取单克隆，接种至