一种混合前体耦合真菌诱导子高效合成纳他霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，具体的说是一种高效生产纳他霉素的方法。
【背景技术】
[0002] 纳他霉素是由纳塔尔链霉菌flateJeasis)、褐黄孢 链霉菌（夕&印广05?7口6'61友77[06770/'6'"61)、恰塔努加链霉菌（ 1%_/'6'/7广05?7口6'61<^?<3^(3刀(90貧6'刀6 1_/61) 和利迪链霉菌（^SYrejOtopeesXn/ici/61)等经发酵产生的一种高效、广谱的多稀大环内酯类 抗生素。其分子式为C33H47NO13，化学结构如式1所不，该分子含有一个二十六元环多稀大环 内酯，环外通过糖苷键链接有一个海藻氨基糖。纳他霉素与留醇化合物具有较高的亲和性， 通过与细胞膜上的留醇化合物反应，由此引发细胞膜结构改变而破裂，导致细胞内容物的 渗漏，使细胞死亡。纳他霉素不仅抗真菌，而且还能抑制真菌毒素的产生，可用于治疗真菌 感染，包括假丝酵母、青霉、曲霉菌、镰刀霉等。由于细菌的细胞壁和细胞膜上不存在这种甾 醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有抑制作用。因其不抑制细菌发酵、安全无毒，所以在乳 制品、肉制品及果蔬等食品工业中也得到广泛的应用，被世界上30多个国家批准为食品防 腐剂。
[0003] 式1纳他霉素化学结构式 1955年，Struykd等人从南非Natal州的土壤样品中分离出纳塔尔链霉菌，并从中首次 分离得到了纳他霉素，我国最早曾译名为匹马菌素、游霉素等。国外关于纳他霉素发酵生产 方面的研究比较深入，相关的专利报道也比较多。而国内对纳他霉素的研究相对滞后，大多 侧重于菌种选育和发酵工艺优化等方面，杨东靖等利用链霉菌抗性与紫外诱变相结合，获 得纳他霉素高产菌株，产量达到2. 80g/L;朱惠等通过基因重排技术，获得纳他霉素产量可 达3. 52g/L的菌株；骆健美等通过对发酵工艺的优化，使纳他霉素产量达到5. 67g/L;同时 国内一些其他的科研机构也在做相关的研究。
[0004] 目前，纳他霉素已在乳制品、饮料、水果、肉类等食品工业中得到广泛的应用，已 经商品化生产的纳他霉素有美国Cyanamid公司的Myprozine，美国GB发酵工业公司 的Delvocid。此外，还有Natafucin、PimafuciruNatamaxvx等商品名称。其中，霉克 OVate皿xTX；是纳他霉素和乳糖按1 :1(质量比）的比例混合而成，可用于食品表面防腐处 理或直接添加到食品中。但是，目前国内纳他霉素的发酵水平还比较低，导致成本太高，限 制了纳他霉素作为一种新型的天然防腐剂在我国实现大规模工业化生产。
【发明内容】
[0005] 本发明的技术目的为：针对目前纳他霉素产量较低的现状，提供一种操作简单，且 能够促进纳塔尔链霉菌高效合成纳他霉素的方法，该方法能显著提高纳他霉素的产量，降 低纳他霉素的生产周期和生产成本。
[0006] 为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：一种高效合成纳他霉素的 方法，包括纳塔尔链霉菌flateJeasis)的发酵，其中，在发酵过程中以 流加的方式向发酵培养基中添加纳他霉素混合前体，在发酵过程中添加真菌诱导子，所 述的纳他霉素混合前体选自丙酸钠、乙酸钠和异亮氨酸，所述的真菌诱导子为产黄青霉 {Penicillium chrysogemmf)抱发養叛。
[0007] 其中，所述的纳他霉素混合前体在发酵过程的添加时间优选在发酵的24h_36h 时，每隔两小时添加一次。所述的真菌诱导子在发酵过程的添加时间优选在发酵60h时。
[0008] 本发明中，所述的纳他霉素混合前体由摩尔比为1 :1~15 :1~15的丙酸钠、乙酸钠 与异亮氨酸组成；其添加量优选〇. 1~1. 〇%(V/V)，最优选〇. 6%(V/V)。
[0009] 本发明中，所述的真菌诱导子为产黄青霉cArjsogefflM?)的发酵液， 优选产黄青霉在发酵培养基中28~34°C摇床培养2~7d的发酵液，所述的发酵培养基为每 1000 mL中含有葡萄糖20~30g，酵母膏l~5g，牛肉膏5~10g。该产黄青霉的发酵培养基的优选 pH6. 8~7. 3。所述的真菌诱导子优选发酵液经纱布过滤后又离心所得的上清液。所述的上 清液优选经过微孔滤膜过滤除菌。所述的微孔滤膜的孔径为〇. 2~1. 25ym，优选0. 45ym。 所述的产黄青霉是任何产黄青霉菌属的菌株。真菌诱导子的添加量优选1~10%(V/V)，更优 选 6%(V/V)。
[0010] 本发明中，所述的真菌诱导子的一较佳制备实例由以下方法制备而得： (1) 真菌的培养：将斜面培养基上的产黄青霉接种于液 体种子培养基中，28~34°C、150~220r/min培养l~7d; 所述的斜面培养基配方为每1000 mL中含有：玉米淀粉50~100g，葡萄糖15~30g，琼脂粉 15~20g; 所述的液体种子培养基配方为每1000 mL中含有：葡萄糖20~30g，酵母膏l~5g，牛肉膏 5~10g，灭菌后pH7. 0~7. 5 ; (2) 将步骤（1)培养好的发酵液先六层纱布过滤，然后8000~12000r/min离心，保留上 清液，最后用微孔滤膜过滤除菌种，即得真菌诱导子。
[0011] 本发明中，发酵中所采用纳塔尔链霉菌种子是本领域常规，优选的方法由包括 以下步骤制备：将斜面培养基上的纳塔尔链霉菌接种于液体种子培养基中，2 6 ~ 3 2 °C培 养2~7d;所述的斜面培养基为每1000 mL中含有：葡萄糖10~20g，麦芽浸膏l~5g，酵母膏 l~5g，胰蛋白胨5~15g，琼脂粉15~20g;所述的液体种子培养基为每1000 mL中含有：葡萄糖 15~30g，蛋白胨5~15g，酵母膏5~10g，氯化钠5~15g。其中，所述的斜面培养基和液体种子 培养基的pH为6. 5~8. 0,优选pH7. 0~7. 5,最优选pH7. 2。
[0012] 本发明中，所述的纳塔尔链霉菌发酵生产纳他霉素所采用的发酵培养基是常规的 纳塔尔链霉菌发酵培养基，本发明优选每1000 mL中含有葡萄糖10~20g，黄豆饼粉20~40g， 可溶性淀粉20~40g，酵母膏5~10g。本发酵培养基pH6. 5~8. 0,优选pH7. 0~7. 5,最优选pH7. 2。
[0013] 本发明中，纳塔尔链霉菌的发酵是常规条件，优选发酵温度26~32°C，发酵时间 5~9d。发酵时优选160~220r/min振荡培养。
[0014] 本发明中，发酵培养基中纳塔尔链霉菌的接种量是常规，优选1~10%(V/V)。
[0015] 本发明中，所述的纳塔尔链霉菌是常规的纳塔尔链霉菌属中的任何菌株。
[0016] 本发明中，所述的各种培养基的配制都是常规方法，将各种原料混合后用蒸馏水 定容即可。所述的培养基使用前都要经过灭菌。需要调PH值的，定容后进行调节pH值。pH 值的调节方法是常规，用酸或碱调节。
[0017] 本发明中，所用的试验材料除特别说明外，市场上均可售得。
[0018] 有益效果： 与现有技术相比，本发明通过向发酵培养基中添加纳他霉素混合前体和真菌诱导子， 大大提高了纳他霉素的产量和纯度，使纳他霉素的产量达到5. 97g/L以上，比不添加混合 前体和真菌诱导子的产量相比提高了 573.1%。同时，合成方法本身工艺简单、物料利用率 高，设备要求低，降低了生产成本，促进了其生产的工业化进程。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，以下实施例中未注明具体实 验条件的，通常按常规条件或制造厂商建议的条件。
[0020] 本发明提供了一种混合前体耦合真菌诱导子促进纳他霉素高效合成的方法，通过 向发酵液中流加纳他霉素混合前体和真菌诱导子来提高纳他霉素的产量。
[0021] 本发明中，所述的纳塔尔链霉菌flateJeasis)购于中国科学院微 生物研究所菌种保藏中心，产黄青霉为本实验室保藏菌种。
[0022] 实施例1 1、种子的制备：从纳塔尔链霉菌斜面培养基上挑取2环孢子于无菌蒸馏水中，制成质 量浓度为5%的孢子悬液，然后按8%(V/V)的接种量接种于含有40mL液体种子培养基的 250mL三角瓶中，30°C、180r/min摇床培养48h。
[0023] 所述的斜面培养基配方为：葡萄糖12g，麦芽浸膏4g，酵母膏4g，胰蛋白胨7g，琼脂 粉20g，加蒸馏水定容至1000mL，灭菌后pH7. 2。
[0024] 所述的液体种子培养基配方为：葡萄糖20g，蛋白胨6g，酵母膏8g，氯化钠8g，加水 定容至lOOOmL，灭菌后pH7. 3。
[0025] 2、真菌诱导子的制备：将斜面培养基上的产黄青霉用无菌蒸馏水制成质量浓度为 5%的孢子悬液，并以5%(V/V)的接种量接种于含有40mL液体培养基的250mL三角瓶中， 30°C、180r/min振荡培养48h。将培养好的发酵液六层纱布过滤，然后10000r/min离心 15min，保留上清液，最后用孔径为0. 22ym的微孔滤膜过滤除菌，即得真菌诱导子。
[0026] 所述的斜面培养基配方为：每1000 mL中含有玉米淀粉80g，葡萄糖25g，琼脂粉 20g〇
[0027] 所述的液体培养基配方为：每1000 mL中含有葡萄糖30g，酵母膏4g，牛肉膏8g，灭 菌后pH7. 2。
[0028]3、发酵培养时，将种子液按5% (V/V)的接种量接种于含有40mL纳他霉素发酵培养 基的250mL三角瓶中，30°C、180r/min振荡培养，在发酵24h时，按照每隔两小时添加一次的 方法，向发酵液中加入比例为0.6%(V/V)的混合前体（丙酸钠：乙酸钠：异亮氨酸=1:7:1)， 在发酵60h时按5%(V/V)的比例添加真菌诱导子。整个发酵过程共7天。
[0029] 所述的纳他霉素发酵培养基配方为：葡萄糖20g，黄豆饼粉30g，可溶性淀粉30g， 酵母膏8g，灭菌后pH7. 2。
[0030] 4、纳他霉素产量的测定：取ImL纳他霉素发酵液，加入9mL甲醇，充分振荡后， 12000r/min离心lOmin，保留上清液，用HPLC法检测纳他霉素的产量达到5. 99g/L。
[0031] 实施例2 1、种子的制备：从纳塔尔链霉菌斜面培养基上挑取2环孢子于无菌蒸馏水中，制成质 量浓度为5%的孢子悬液，然后按8%(V/V)的接种量接种于含有40mL种子培养基的250mL 三角瓶中，32 °C、200r/min摇床培养48h。
[0032] 所述的斜面培养基配方为：葡萄糖1