一种提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程生物技术领域，更具体涉及一种有效提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的工艺方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌表达系统具有遗传背景清晰、生长周期短、培养成本低、表达水平高及操作简便等优点，是目前基因工程生物技术领域最优先考虑的的重组蛋白质表达系统。由于重组目的基因存在结构不稳定性和分配不稳定性，使得重组大肠杆菌难以进行连续培养。为了解决这一问题，人们把重组大肠杆菌的培养分为种子生长阶段和诱导表达阶段。种子生长阶段用于菌种的增殖和重组基因的扩增；诱导表达阶段需要向种子生长阶段获得的培养物中加入诱导物，诱导重组基因的表达和重组蛋白质的合成。大肠杆菌的最适生长温度是37°C，重组大肠杆菌通常也用这一温度进行种子培养和诱导表达，或者为了提高重组蛋白质的活性，也可以采用较低的生长温度(方宏清.影响重组大肠杆菌培养的因素及其培养方式.生物工程进展.1992.第12卷第6期.第21-24页.)。此外，温敏型调控的重组大肠杆菌则不需要添加诱导物，是一个例外。
[0003]但是，大肠杆菌表达系统产生的重组蛋白质往往不能正确折叠，最终形成不溶性、无生物活性的包涵体。包涵体中蛋白质必须经过后期变复性操作来获得可溶性，这一过程操作复杂且收率低，显著增加了蛋白质纯化的成本。寻找简便、易行、通用性强的提高重组蛋白质可溶性表达的方法是目前大肠杆菌表达体系的一个难点和瓶颈环节。
[0004]目前科学家们主要尝试以下策略来提高重组蛋白质的可溶性:(I)采用低温培养及优化的培养基等条件；(2)共表达分子伴侣蛋白质、二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等蛋白质；(3)将重组蛋白质与溶解性很好的金黄色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-转移酶、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白malE、大肠杆菌硫氧还蛋白等蛋白质以融合蛋白质的形式表达，借助这些融合伙伴蛋白使所需要的重组蛋白质亦获得可溶性的大量表达，从而避免包涵体产物的生成。其中，第(I)类策略需要经较多尝试以摸索适当的培养基配方及工程菌培养条件；第
(2)类策略需要选定合适的分子伴侣蛋白，再利用基因工程技术构建相应表达载体，将表达载体导入工程菌，过程复杂，操作繁琐；第(3)类策略在获得重组融合蛋白质后，必须再用价格昂贵的蛋白酶加工后才能获得所需的目的蛋白质，后期纯化成本较高。(参考:一种高效原核表达载体(授权公告号:CN 1189565C);一种在大肠杆菌中生产可溶性重组蛋白质的方法及其应用(授权公告号:CN 100334216C);一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法(申请公布号:CN 104561200 A)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种有效提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的工艺方法，具有简便有效、成本低廉、易于规模放大的特点，有助于丰富和增强研究人员提高外源基因可溶性表达的的认识与手段，适用于生物工程及基因工程中用大肠杆菌表达各种可溶性重组蛋白质。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:
(1)将表达重组蛋白的工程菌冻存液接种到表达用LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜获得种子液；
(2)随后将种子液按接种到表达用LB液体培养基中，37°C继续振荡培养，然后将培养温度升高至40°C继续培养；
(3)待培养液0D_达预设诱导起点后，向培养液中添加诱导物，继续培养，菌体内可以产生显著的可溶性重组蛋白质。
[0007]其中，步骤(I)中所述接种冻存液的比例为0.1% ；
其中，步骤(2)中所述接种种子液的比例为1% ;所述37°C振荡培养至培养液0D_达到预设诱导起点的75%?90% ;所述40°C培养0.5?1.5hr ；
其中，步骤(3)中所述添加诱导物后继续培养条件为以37°C或者40°C振荡培养6hr。
[0008]本发明具有以下优点:
(O本发明使用现有培养及发酵设备，无需增添新复杂设备；所用工艺操作非常简单易行，易于放大规模生产；采用本发明所述工艺，基于利用大肠杆菌自身的热激蛋白促进重组蛋白质的折叠，提高重组蛋白质的可溶性，这一机理对于各种在大肠杆菌中表达的重组蛋白质均是适用的。
[0009](2)本发明以温和热休克诱导大肠杆菌工程菌表达自身具有的热激蛋白，以热激蛋白为伴侣分子增强重组蛋白质可溶性表达，无需以基因工程等手段构建分子伴侣蛋白质载体或融合表达载体，无需采用后续转化及共表达等繁琐手段。
[0010](3)本发明采用加入诱导物之前对大肠杆菌工程菌进行温和热休克，激发大肠杆菌工程菌适度表达自身的热激蛋白，有利于重组蛋白质的折叠，从而稳定后续诱导中产生的重组蛋白质，改善重组蛋白质在大肠杆菌中的可溶性表达。这是一种通用性较强的提高可溶性重组蛋白质表达量的新工艺，而且无需【背景技术】中所述的复杂尝试及繁琐操作。
【附图说明】
[0011]图1为一种有效提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的工艺方法流程示意图。
[0012]图2为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测可溶性重组PK2 β所得结果。其中，泳道1:蛋白质分子量标准；泳道2:样品组工程菌；泳道3:对照组工程菌I ;泳道4:对照组工程菌2 ;泳道5:对照重组ΡΚ2 β。
[0013]图3为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测可溶性重组ΡΚ2 β所得结果。其中，泳道1:对照重组ΡΚ2 β ;泳道2:对照组工程菌I ;泳道3:样品组工程菌；泳道4:蛋白质分子量标准；泳道5:对照组工程菌2。
【具体实施方式】
[0014]以下结合实施例对本发明做进一步的描述:
实施例1:
所用演示菌株A cWi BL21 (DE3)pET-PK2i3 (闻崇炜等.响应面分析法优化重组原动蛋白2β诱导条件的研究.生物技术通报.2012.第173-178页)工程菌为自主构建。所用LB液体培养基为每升含有蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g。配制好的LB培养基在高压灭菌锅内以121°C灭菌20min。向灭菌好的LB培养基中再加入卡那霉素至终浓度为50 μ g/mL即得实施例所用的表达用新鲜LB培养基。同时以乳糖为诱导物，实施例中加乳糖至终浓度为 lg/L。EDTA 碎菌液含有 0.05 mol.L 1 Tris.HCl pH 8.0,0.10 mol.L1NaCl，0.025 mol.L 1 EDTA ;高渗液为0.02 mol.L 1 Tris*HCl,0.025 mol.L 1 EDTA，pH 8.0，35% (w/v)蔗糖，低渗液为 0.02 mol.L1 Tris.HCl，0.025 mol.L1 EDTA，pH 8.0。
[0015]样品组工程菌培养过程如下:(I)将_70°C冻存的E.coli BL21 (DE3) ρΕΤ_ΡΚ2 β工程菌在无菌环境下按照0.1% (ν/ν)的比例接种到3mL表达用新鲜LB培养基中，37°C，250rpm培养过夜获得种子液；(2)在无菌环境下，按照1% (ν/ν)的比例将种子液加入250mL表达用新鲜LB培养基中，于37°C，250rpm继续培养。当培养液的0D_达到1.05时，将培养温度升高至40°C，250rpm继续培养1.5hr，此时培养液的0D_达到预设的1.40，然后加入诱导物，继续以37°C，250rpm继续培养4.5hr后结束诱导，将培养液以10000 rpm离心5min，弃上清，菌体保存于_20°C备用。
[0016]对照组工程菌I培养过程如下:(I)将_70°C冻存的E.coli BL21(DE3)pET_PK2 β工程菌在无菌环境下按照0.1%(ν/ν)的比例接种到3mL表达用新鲜LB培养基中，于37°C，250rpm培养过夜获得种子液；(2)在无菌环境下，按照1% (ν/ν)的比例将种子液加入250mL表达用新鲜LB培养基中，于37°C，250rpm继续培养，至培养液的0D_达到1.40，然后加入诱导物，然后以37°C，250rpm继续培养4.5hr后结束诱导，将培养液以1000rpm离心5min，弃上清，菌体保存于_20°C备用。
[0017]对照组工程菌2培养过程如下:(I)将_70°C冻存的E.coli BL21(DE3)pET_PK2 β工程菌在无菌环境下按照0.1%(ν/ν)的比例接种到3mL表达用新鲜LB培养基中，于37°C，250rpm培养过夜获得种子液；(2)在无菌环境下，按照1% (ν/ν)的比例将种子液加入250mL表达用新鲜LB培养基中，于37°C，250rpm继续培养，至培养液的0D_达到0.60，然后加入诱导物，然后以37°C，250rpm继续培养6hr后结束诱导，将培养液以1000rpm离心5min，弃上清，菌体保存于_20°C备用。
[0018]重组蛋白质表达分析过程如下:(1)称取12mg工程菌及对照菌体，分别加ImLEDTA破菌缓冲液重悬，随后颠倒混匀过夜，8000rpm离心5min离心，弃上清，收集菌体；(2)菌体中加入ImL高渗液重悬2