聚胸腺嘧啶模板、基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法、atp的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纳米材料以及分子检测领域，具体涉及一种聚胸腺嘧啶模板、一种基 于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法、和一种ATP的检测方法。
【背景技术】
[0002] ATP对许多酶的活性有着重要影响，其增加或减少都会引起各种疾病，如低氧、低 血糖、帕金森症以及恶性肿瘤等。因此，ATP的简单快速检测对相关疾病的治疗是至关重要 的。目前检测ATP的方法主要是采用荧光素和荧光素酶检测。虽然其检测精度高，但成本 高昂，而且步骤相对复杂，不适合快速检测。
[0003] 因此，有必要提供一种成本低，而且简单易行，能快速、高灵敏检测ATP的方法。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种聚胸腺嘧啶模板及其应用。本发明还提供了 一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇及其制备方法和应用。本发明还提供了一种ATP 的检测方法。
[0005] 本发明提供的聚胸腺嘧啶模板能用于制备荧光铜纳米簇；且制备成本低、操作简 便。本发明提供的ATP的检测方法在生物医学研究和疾病早期诊断方面具有广阔的应用价 值，不仅成本低，而且检测步骤简单易行，现象明显，易于观察，能快速、高灵敏检测样品中 ATP的浓度。
[0006] 本发明所述"ATP"是指三磷酸腺苷。
[0007] 本发明所述"DNA"是指脱氧核糖核苷酸。
[0008] 本发明所述的"A"、"T"、"C"、"G"、"U"分别为腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、 胞嘧啶。
[0009] 本发明所述的" (Y)n"表示n个Y序列，Y为腺嘌呤（A)、胸腺嘧啶（T)、胞嘧啶（C) 或鸟嘌呤（G)。
[0010] 第一方面，本发明提供了一种聚胸腺嘧啶模板，所述聚胸腺嘧啶模板为单链DNA 序列，所述聚胸腺嘧啶模板包括至少一个聚胸腺嘧啶序列，所述聚胸腺嘧啶序列为（T)n，其 中，所述n的取值范围为15~40之间的自然数。
[0011] 具体地，本发明所述的"⑴n"表示n个T序列。
[0012] 具体地，当n为25时，所述聚胸腺嘧啶序列为⑴25,所述⑴25的序列如SEQID NO: 1所示。
[0013] 优选地，所述聚胸腺啼陡模板还包括至少一个聚胞啼陡序列。
[0014] 进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列为"（C)m"，所述m的取值范围为5~20之间的 自然数。
[0015] 具体地，当n为10时，所述聚胞嘧啶序列为（C)n为（C) 10,所述（C) 10的序列如 SEQIDNO: 2 所示。
[0016] 进一步优选地，所述聚胸腺啼陡模板中，所述聚胞啼陡序列和所述聚胸腺啼陡序 列依次间隔排列，且所述聚胞嘧啶序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
[0017] 更进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1~3次。
[0018] 具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列 如SEQIDNO: 3 所示。
[0019] 具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为2次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列 如SEQIDNO:4 所示。
[0020] 优选地，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚鸟嘌呤序列。
[0021] 进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列为"（G)q"，所述q的取值范围为5~20之间的 自然数。
[0022] 进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述聚鸟嘌呤序列 依次间隔排列，且所述聚鸟嘌呤序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
[0023] 更进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列的重复次数为1~3次。
[0024] 优选地，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个10~20个碱基长度的随机序列。
[0025] 进一步优选地，所述聚胸腺啼陡模板中，所述聚胞啼陡序列和所述随机序列依次 间隔排列，且所述随机序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
[0026] 更进一步优选地，所述随机序列的重复次数为1~3次。
[0027] 在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7 或SEQIDNO:8 所示。
[0028] 优选地，所述聚胸腺嘧啶模板的5'端连接有生物素标记或链霉亲和素标记。
[0029] 在此在此优选条件下，所述生物素标记或链霉亲和素标记通过行业内常规操作修 饰在聚胸腺嘧啶模板的5'端。
[0030] 在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为T25-biotin，其中，所述T25 的序列如SEQIDNO: 1所示。
[0031] 具体的，所述T25-biotin表示在SEQIDNO: 1所示序列的5'端标记生物素标签。
[0032] 本发明提供的标记有生物素或链霉亲和素的聚胸腺嘧啶模板不仅可以用于制备 荧光铜纳米簇，还可以用于纯化、富集、观察所制备的荧光铜纳米簇，方便所制备的荧光铜 纳米簇的应用，在制备ATP检测试剂盒中具有较大的应用价值。
[0033] 本发明提供的聚胸腺嘧啶模板选用15~40bp的寡聚胸腺嘧啶DNA单链序列作为 制备荧光铜纳米簇的模板，制得的铜纳米颗粒与DNA单链结合紧密，荧光稳定性较双链更 高，能在1小时之内保持稳定的荧光发光；其次，所制备的荧光铜纳米簇即使在无荧光仪精 确定量的情况下也可在紫外灯下看出明显的现象，使得医疗、实验等检测工作更加简便、适 用性更高；此外，寡聚胸腺嘧啶DNA单链成本相对于双链更加低廉，采用本发明提供的聚胸 腺嘧啶模板制备ATP检测试剂盒能降低生产成本。
[0034] 第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的聚胸腺嘧啶模板在制备荧光铜纳 米簇、检测ATP或制备检测ATP的试剂盒中的应用。
[0035] 第三方面，本发明提供了一种基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇的制备方法， 包括如下步骤：
[0036] 1)提供聚胸腺嘧啶模板、还原剂、和含Cu2+的溶液，其中，所述聚胸腺嘧啶模板为 单链DNA序列，所述聚胸腺嘧啶模板包括至少一个聚胸腺嘧啶序列，所述聚胸腺嘧啶序列 为（T)n，其中，所述n的取值范围为15~40之间的自然数；
[0037] 2)将步骤⑴所述聚胸腺嘧啶模板、还原剂、和含Cu2+的溶液加入到缓冲溶液中， 轻微混匀并反应，得到所述基于聚胸腺嘧啶模板的荧光铜纳米簇，其中，所述聚胸腺嘧啶模 板和Cu2+的摩尔比为1:100~1 :500。
[0038] 优选地，所述步骤（1)中，所述聚胸腺嘧啶模板还包括至少一个聚胞嘧啶序列。
[0039] 进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列为"（C)m"，所述m的取值范围为5~20之间的 自然数。
[0040] 具体地，当n为10时，所述聚胞嘧啶序列为（C)n为（C) 10,所述（C) 10的序列如 SEQIDNO:2 所示。
[0041] 进一步优选地，所述聚胸腺啼陡模板中，所述聚胞啼陡序列和所述聚胸腺啼陡序 列依次间隔排列，且所述聚胞嘧啶序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
[0042] 更进一步优选地，所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1~3次。
[0043] 具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为1次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列 如SEQIDNO: 3 所示。
[0044] 具体地，当所述聚胞嘧啶序列的重复次数为2次时，所述聚胸腺嘧啶模板的序列 如SEQIDNO:4 所示。
[0045] 优选地，所述步骤（1)中，所述聚胸腺啼陡模板还包括至少一个聚鸟嘌呤序列。
[0046] 进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列为"（G)q"，所述q的取值范围为5~20之间的 自然数。
[0047] 进一步优选地，所述聚胸腺嘧啶模板中，所述聚胞嘧啶序列和所述聚鸟嘌呤序列 依次间隔排列，且所述聚鸟嘌呤序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
[0048] 更进一步优选地，所述聚鸟嘌呤序列的重复次数为1~3次。
[0049] 优选地,所述步骤（1)中，所述聚胸腺啼陡模板还包括至少一个10~20个碱基长 度的随机序列。
[0050] 进一步优选地，所述聚胸腺啼陡模板中，所述聚胞啼陡序列和所述随机序列依次 间隔排列，且所述随机序列的两侧为所述聚胸腺嘧啶序列。
[0051] 更进一步优选地，所述随机序列的重复次数为1~3次。
[0052] 在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为如SEQIDNO:6、SEQIDNO:7 或SEQIDNO:8 所示。
[0053] 优选地，所述步骤（1)中，所述聚胸腺嘧啶模板的5'端连接有生物素标记或链霉 亲和素标记。
[0054] 在此在此优选条件下，所述生物素标记或链霉亲和素标记通过行业内常规操作修 饰在聚胸腺嘧啶模板的5'端。
[0055] 在此优选条件下，所述聚胸腺嘧啶模板的序列优选为T25-biotin，其中，所述T25 的序列