一种分子标记辅助选育绿豆抗豆象品种的方法

文档序号:9367894阅读:333来源:国知局
一种分子标记辅助选育绿豆抗豆象品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域,涉及一种分子标记辅助选育绿豆抗豆象品种的方法, 特别涉及一种用于检测绿豆对豆象抗性的引物对,以及其在分子标记辅助选育绿豆抗豆象 品种中的应用。
【背景技术】
[0002] 绿豆(Vignaradiata)是一种豆科、蝶形花亚科SE豆属植物,中国是绿豆的发源 地之一,拥有类型繁多的绿豆品种资源。中国、緬甸等国是主要的绿豆出口国。由于其生 育期短、适应性广,且具有较好的固氮能力,因此是种植业资源合理配置、倒茬轮作、间作套 种、减灾救灾不可缺少的粮食作物及贫困地区农民致富的重要经济作物;同时绿豆富含蛋 白质、维生素、多种矿物质及人体必需的氨基酸,还具有清热解毒、降血压和胆固醇、防止动 脉粥样硬化等功效,具有较高的营养保健和经济价值,在国际市场上备受青睐。近年来,国 际市场对绿豆的需求量和全世界绿豆的生产量均有所增加,目前中国的绿豆年出口量在 20-30万吨,出口价格一般400-500美元。绿豆的社会经济价值不容忽视。
[0003] 然而,豆象是危害绿豆最严重的仓储害虫,豆象分布范围广,在任何种植和储藏 食用豆的地方都可发生绿豆象危害。在一个生活周期内,因绿豆象危害一般损失产量 30% -56%,可导致整仓绿豆被破坏。在我国,绿豆象每年可繁殖4-11代,除危害绿豆外, 还可危害小豆、豇豆、豌豆、蚕豆、菜豆、扁豆等。国内外对绿豆豆象的研究还相当滞后,虽然 国内外已进行了多年的抗豆象研究,但抗豆象相关基因方面的研究进展缓慢。首要原因是 绿豆尚无全基因组序列信息,SSR分子标记匮乏,基本都使用RFLP、RAH)和AFLP标记,这些 标记存在一定的局限性,如RFLP标记所需DNA量大,操作繁琐、周期长、成本高、成功率低、 有放射性污染等弊端。RAH)标记不能鉴别杂合子和纯合子,还存在稳定性和重复性差等缺 点。AFLP标记技术难度大,费用高。这些标记限制了对绿豆抗豆象的分子研究,这与十年前 水稻基因的遗传研究很相似。但自从完成水稻全基因组测序后,开发了大量的SSR,STS和 SNP等标记,特别是SSR标记的使用极大地促进了水稻基因的图位克隆研究。SSR标记具有 重复性好、多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优点,使得SSR标记成为广泛使用的 分子标记。
[0004] 随着第二代测序技术的迅猛发展,其高通量、快速、低成本的特点成为越来越多的 生物学研究者在解决生物学问题时的首选,尤其在转录组测序方面更显示出极大的潜力。 转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带,同时相对于真核生物全基因组测序 来说,转录组测序得到的序列不含有内含子及其它非编码序列,因此转录组测序有着无可 比拟的高性价比优势。通过绿豆转录组测序来开发SSR标记是一种简单高效的途径,这些 新的EST-SSR分子标记对绿豆的分子遗传研究提供了有利的条件。
[0005] 从20世纪80年代开始,日本、泰国、澳大利亚等国家的食用豆类遗传育种学家致 力于抗豆象的研究。国内的抗豆象资源较为稀缺,目前为止,报道的高抗豆象绿豆资源主要 有来自于非洲马达加斯加野生种TC1966和来自于澳大利亚野生种ACC41。TC1966被广泛 应用于绿豆遗传育种研究。
[0006] 目前,生产上防治豆象危害的主要方法为磷化铝熏蒸法,这不仅增加了食用豆生 产的成本,而且容易导致农药残留,造成环境污染,影响食用者身体健康。因此研究开发抗 豆象基因紧密连锁标记,克隆抗豆象基因,应用分子标记辅助选择育种技术培育抗豆象绿 豆新品种,是防治豆象危害最为经济且环保的方法,对于减轻豆象危害,保障我国绿豆安全 生产具有非常重要的意义。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是针对绿豆常规抗豆象育种方法只能依靠收获后进行抗豆象鉴定 所带来的周期长、操作繁琐以及耗时费力等缺点,提供一种省时、省力、准确、快捷的分子标 记辅助选育绿豆抗豆象品种的选育方法,具体涉及了一种用于检测绿豆对对象抗性的引物 对及其应用。
[0008] 本发明所提供的用于检测绿豆对豆象抗性的引物对,具体为由序列表中序列1所 示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
[0009] 所述引物对中,两条单链DNA分子既可以分别单独包装,也可以混合包装。如果混 合包装,两条单链DNA分子的摩尔比可为1:1。
[0010] 所述引物对在检测绿豆对豆象抗性中的应用也属于本发明的保护范围。
[0011] 本发明还提供了 一种用于检测绿豆对豆象抗性的试剂盒。
[0012] 本发明所提供的用于检测绿豆对豆象抗性的试剂盒,具体可含有所述的引物对, 以及PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
[0013] 所述引物对的制备方法和所述试剂盒的制备方法也均属于本发明的保护范围。
[0014] 本发明所提供的检测绿豆对豆象抗性的方法,具体可包括如下步骤:
[0015] (al)以待测绿豆的基因组DNA为模板,以所述的引物对进行PCR扩增,获得PCR产 物;
[0016] (a2)检测步骤(al)所得PCR产物的大小,按照如下方法确定所述待测绿豆对豆象 的抗性:若所述PCR产物中含有大小为106bp的DNA片段,则所述待测绿豆为或候选为抗豆 象绿豆;若所述PCR产物中含有大小为120bp的DNA片段,则所述待测绿豆为或候选为感豆 象绿豆。
[0017] 在实际应用中,判断PCR产物中是否含有目的DNA片段时,可通过将PCR产物进行 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度具体可如8% ),看电泳图谱上是否含有目的条带: 电泳图谱上含有目的条带,则PCR产物中含有目的DNA片段。
[0018] 在所述方法中,所述大小为106bp的DNA片段为序列表中序列3所示DNA片段;所 述大小为120bp的DNA片段为序列表中序列4所示DNA片段。
[0019] 在实际应用中,判断PCR产物中是否含有序列3或序列4所示DNA片段,可通过对 PCR产物进行核苷酸序列测定来判断。
[0020] 在所述方法中,以所述引物对进行PCR扩增的退火温度为50°C。
[0021] 在本发明的一个实施例中,以所述引物对进行PCR扩增的程序具体为:95°C预变 性5min;95°C变性30s,50°C退火45s,72°C延伸30s,进行33个循环;最后72°C延伸5min。
[0022] 所述的引物对或所述试剂盒或所述方法在如下(I)-(IV)任一中的应用也属于本 发明的保护范围:
[0023] (I)筛选抗豆象绿豆品种;
[0024] (II)筛选感豆象绿豆品种;
[0025] (III)培育抗豆象绿豆品种;
[0026] (IV)培育感豆象绿豆品种。
[0027] 本发明的另外一个目的是提供一种培育抗豆象(或感豆象)绿豆品种的方法,包 括采用通过以上所述方法检测得到的所述抗豆象(或感豆象)绿豆品种作为亲本进行育种 的步骤。
[0028] 在本发明中,所述抗豆象或所述感豆象具体体现在种子被害率这一指标上。具体 而言,所述抗豆象绿豆为种子被害率在35%以下的绿豆;所述感豆象绿豆为种子被害率在 65%以上的绿豆。
[0029] 其中,所述种子被害率为受害种子粒数与每份材料鉴定的总粒数的比值。更加 具体的,所述种子被害率的测定方法参见"程须珍.绿豆抗豆象基因源发掘与创新利用研 究.中国农业科学院,2006年硕士论文"一文进行。
[0030] 在本发明中,所述豆象具体为绿豆象。
[0031] 在本发明的一个实施例中,所述待测绿豆具体为由绿豆亲本TC1966(抗豆象)和 绿豆亲本VC1973A(感豆象)杂交产生的F2分离群体94个单株衍生的F2:3家系。
[0032] 本发明利用第二代高通量测序技术,对绿豆抗、感豆象近等基因系材料VC6089A 和VC1973A进行转录组测序,开发抗豆象相关的EST-SSR标记,并筛选出抗豆象亲本TC1966 和感豆象亲本材料VC1973A间的多态性标记,并对产生的F2分离群体94个单株进行验证, 获得了抗豆象基因连锁标记(序列1和序列2组成的引物对)。实验证明,本发明对由抗、 感豆象亲本TC1966和VC1973A杂交产生的F2分离群体94个单株对绿豆象的分子检测及抗 性统计实验结果表明,采用本发明所提供的引物对(序列1和序列2)扩增出106bp目的条 带(序列3)的绿豆全部表现出抗豆象;而采用本发明所提供的引物对(序列1和序列2) 扩增出120bp目的条带(序列4)的绿豆全部表现出感豆象。可见,本发明所提供的检测绿 豆对豆象抗性的方法可靠、简便、实用,在绿豆种质资源评价和育种标记的辅助选择中具有 重要应用前景,同时为培育对豆象高抗的绿豆品种提供了参考依据。
【附图说明】
[0033] 图1为实施例1中部分SSR重复基元类型和数量。
[0034] 图2为实施例2中采用引物对A检测抗豆象亲本TC1966,感豆象亲本VC1973A以 及它们杂交的F2分离群体DNA进行多态性验证的结果。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如
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