一种山茶根结线虫的pcr检测引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及根结属线虫的检测技术，具体涉及一种山茶根结线虫的PCR检测引物及试剂盒。
【背景技术】
[0002]根结属线虫(ife^o1baneGoeldi, 1887)为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将根结线虫(非中国种)列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。目前已知的根结属线虫为98种，其中大多数尚未在我国发现，是重要的检疫性线虫。山茶根结线虫camelIiae Golden1978为宁波口岸于2012年首次从来自日本的山茶和茶梅中截获，随后对该批样品做了检疫除害处理。目前对山茶根结线虫的检测除形态学鉴定外，公开号为CN103924001的发明专利申请公开了快速检测山茶根结线虫的LAMP方法，虽然特异、灵敏，但检测成本较高。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性较强、灵敏度较高、成本较低的山茶根结线虫的PCR检测引物及试剂盒。
[0004]本发明系选择参考GenBank中山茶根结线虫的核糖体ITS基因(InternalTranscribed Spacer)，使用 Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp)设计了特异性引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估(以山茶根结线虫的DNA为模板，南方根结线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行PCR检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物)，筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。
[0005]本发明的一种山茶根结线虫的PCR检测引物，该PCR检测引物的核苷酸序列如下所示:
上游引物:5’ - TTCGAGAAAC TTGGGGACCG -3’
下游引物:5’ - ATGTCCTCAA ACGCGTCACT -3’。
[0006]山茶根结线虫的PCR检测试剂盒，其组成成份如下??无Mg2+的10XPCR缓冲液、浓度为25 mM的MgCl2溶液、浓度为0.1 mM的dNTP溶液、浓度5 U/μ?的Taq酶溶液、浓度为?ο μΜ的上游引物溶液和浓度为?ο μΜ的下游引物溶液。
[0007]与现有技术相比本发明优点在于一种山茶根结线虫的PCR检测引物及试剂盒，主要包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列:TTCGAGAAAC TTGGGGACCG，下游引物的核苷酸序列:ATGTCCTCAA ACGCGTCACT。该特异性引物对山茶根结线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为361 bp，对其它根结线虫无特异性条带片段；应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，其特异性较强，灵敏度较高，实用性较强，成本较低。
【具体实施方式】
[0008]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0009]实施例1、山茶根结线虫的PCR检测试剂盒
100次或200次反应体系，50 PL反应体系包括:无Mg2+的10XPCR缓冲液5.Ομ?，浓度为25 mM的MgCl2溶液5.Ομ?,浓度为0.1 mM的dNTP溶液4.Ομ?,浓度5 U/μ?的Taq酶溶液0.6μ?,浓度都为ΙΟμΜ的上游引物溶液和下游引物溶液各3.Ομ?。Taq酶液，dNTP液购于宝生物工程(大连)有限公司，其中上游引物溶液含有核苷酸序列为TTCGAGAAAC TTGGGGACCG的引物，下游引物溶液含有核苷酸序列为ATGTCCTCAA ACGCGTCACT引物。
[0010]实施例2、DNA提取方法
挑取单条线虫放入200μ? PCR管中[已加有1PL双蒸水和5μ? 10XPCR缓冲液(无Mg2+)]，液氮中放置I min (或-70度放置0.5 h)以上，取出后立即85°C加热2 min。然后向PCR管中加入I PL I mg/mL蛋白酶K，56°C加热30 min以上，95°C加热10 min，得到DNA模板。
[0011 ] 实施例3、PCR检测方法
用山茶根结线虫的PCR检测试剂盒进行检测，PCR反应体系为:无Mg2+的10XPCR缓冲液5.Ομ?,浓度为25 mM的MgCl2溶液5.Ομ?,浓度为0.1 mM的dNTP溶液4.Ομ?,浓度5 U/μ?的Taq酶溶液0.6μ?,浓度都为ΙΟμΜ的上游引物溶液和下游引物溶液各3.Ομ?, DNA模板 1.0 ?3.Ομ?，ddH20 补齐 50μ?。PCR 反应条件:94°C 4 min ；94°C 40 sec, 52°C I min,72°C 1.5 min，36个循环；72°C 8 min。电泳:将5μ? PCR产物用1.0% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经DNA染料染色后于紫外凝胶成像系统下显像，出现特异性片段大小为361 bp，则为山茶根结线虫。
[0012]实施例4、山茶根结线虫的特异性和敏感性试验
用实施例2的提取方法，实施例3的PCR检测方法，分别对本发明人在宁波采集的各根结线虫:山茶根结线虫(采自日本进口的山茶)、苹果根结线虫(采自日本进口的鸡爪槭)、爪哇根结线虫(采自福建福州的烟草)、南方根结线虫(采自云南路南县的烟草)、花生根结线虫(采自江苏徐州产的番茄)、北方根结线虫(采自山东菏泽产的牡丹)、象耳豆根结线虫(采自海南儋州产的番石榴)和西班牙根结线虫(采自海南儋州产的番木瓜)进行检测，只有山茶根结线虫能进行有效扩增，出现条带，且其特异性片段大小为361 bp，说明本发明一对引物具有很好的特异性。对山茶根结线虫的DNA模板进行10°、1-1UO-2UO-3UO-4UO-5稀释，再进行PCR检测，结果显示PCR检测限为原液稀释10 2倍。
【主权项】
1.一种山茶根结线虫的PCR检测引物，其特征在于该PCR检测引物的核苷酸序列如下所示: 上游引物:TTCGAGAAAC TTGGGGACCG 下游引物:ATGTCCTCAA ACGCGTCACT。2.由权利要求1所述的一种山茶根结线虫的PCR检测引物组成的PCR检测试剂盒，其特征在于组成成份如下:无Mg2+的1XPCR缓冲液、浓度为25 mM的MgCl2溶液、浓度为0.1mM的dNTP溶液、浓度5 U/μ?的Taq酶溶液、浓度为10 μΜ的上游引物溶液和浓度为10 μΜ的上游引物溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种山茶根结线虫的PCR检测引物及试剂盒，主要包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列：TTCGAGAAAC？TTGGGGACCG，下游引物的核苷酸序列：ATGTCCTCAA？ACGCGTCACT。该特异性引物对山茶根结线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为361bp，对其它根结线虫无特异性条带片段；应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，其特异性较强，灵敏度较高，实用性较强，成本较低。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105087800
【申请号】CN201510526631
【发明人】顾建锋, 陈先锋, 何洁
【申请人】宁波检验检疫科学技术研究院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月25日