一种鉴定低酚棉花品种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴定低酚棉花品种的方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 棉花是我国主要的经济作物，集纤维、蛋白、油用于一体，其中棉纤维已得到充分 利用；蛋白、油来源于棉籽，棉籽中除了含有18 % -20 %的油脂外，还含有22 % -24 %的蛋白 质。棉籽榨油后的棉仁粉，蛋白质含量更可高达45% -50%，远胜过稻米、小麦、甚至花生、 大豆的蛋白质含量，而且含有小麦、稻米以至大豆所欠缺的一些人体所必需的基本氨基酸。 棉仁中还含有35%以上的棉仁油，在食用油中，亚油酸含量最高的莫过于棉仁油。棉仁油的 亚油酸含量高达55. 6%，是一种亚油酸含量极高的高级保健油。因此，棉籽不仅是重要的植 物油料，而且是世界上仅次于大豆的重要植物蛋白资源。但因棉籽中含有对人畜有毒的棉 酚及其衍生物，棉籽蛋白质和油用资源的利用一直受到限制。棉酚及其衍生物是对人类和 单胃动物有很高毒性的一种化学物质，但棉株部位的棉酚却是棉花自身防御病虫危害的重 要组成部分，植株部位缺少棉酚会导致棉花病虫的危害而使产量大幅下降。因此，为了提高 棉花的综合利用价值，科学家一直将选育不含棉酚的棉花品种作为工作重点。
[0003] 在棉花中已发现多种类型的低酚基因资源，其中仅有两种类型即双隐性低酚 (gl2gl3)和显性低酚（G12e)具有实际利用价值。Afifi等人通过32P辐射诱变海岛棉 (G.barbadenceL.)，获得一个无腺体突变体，命名为"BahtimllO"。遗传研究结果表明，该 性状受到一对显性主基因控制，并命名为G12e。它可以有效地抑制棉酚腺体的形成。董承 光利用陆地棉遗传标准系TM-I和海岛棉无腺体突变品系海1构建的1599个F2单株，对无 腺体突变基因G12e进行了精细定位。遗传研究进一步证明，该基因是一不完全显性单基 因。利用SSR标记将G12e基因定位在CIR362和NAU2251b之间，遗传距离分别为9. 27和 0. 96cM。经典遗传学分析表明，gl2和gl3两对隐性基因控制棉酚发育，分别位于棉花第12 和26染色体，当两对隐性基因纯合时，棉花植株和棉籽均表现为无腺体。2001年张雪林等 分析湘x9628棉酚发育特性表明：湘x9628植株有腺体、种子低棉酚特性由二对重叠隐性基 因控制，等位性测验表明，其中一对基因是gl2的等位基因，另一对是gl3的复等位基因，它 对gl3表现为隐性，可能是控制棉酚发育的一个新基因。
[0004] 随着新技术在棉花育种中的应用，棉花产业的发展越来越快，新品种选育周期缩 短，审定速度加快、品种数量增多。目前棉花品种选育过程中所用的亲本遗传基础愈加狭 窄，骨干亲本数量有限且反复利用，在原品种基础上改良少数或单个性状的衍生品种增多， 一些棉花新品种形态越来越相似，通过传统的形态标记方法鉴别越来越困难，而且鉴定结 论也常常存在疑问。目前生产中使用的品种存在非常大的类同性，甚至用未审定的假品种 充当新品种，严重影响种子市场秩序和农业生产安全。因此急需建立一套客观、可靠、易操 作的鉴别技术为不同的棉花品种编制对应的指纹身份证号。这是司法鉴定品种真实性和纯 度的迫切要求，也是对棉花新品种权保护的重要保证。随着现代分子生物技术的发展，分 子标记技术由于不受取材部位、取材时间及环境的影响，已经被作为一种进行品种纯度和 真实性鉴定的常规方法。目前，用于鉴定品种的分子标记类型很多，包括RAPD、SSR、ISSR、SRAP、AFLP等，其中SSR标记具有结果稳定，重复性好等特点，被认为是进行品种鉴定的一 种比较理想的标记，被广泛应用在棉花品种指纹图谱构建和遗传多样性分析中。李成奇等 利用20对SSR核心引物构建了百棉系列棉花自交系品种（系）的DNA指纹图谱。赵亮等 利用26对SSR引物构建12个品种DNA指纹图谱。聂新辉等利用40对SSR引物构建了51 份新陆早系列棉花品种的DNA指纹图谱。
[0005] 低酚棉花品种的选育相对落后，但是随着中国内地棉花种植面积的不断减少以及 植棉经济效益的降低，棉花育种家会越来越重视特种棉花品种的选育，其中低酚棉的种仁 具有重要利用价值，所以通过选育低酚棉提高棉花的综合利用价值将会是其中一个重点方 向和热点内容。我国从1986年开始用显性无腺体海岛棉品系海1与早熟、抗病、丰产的陆 地棉杂交，把显性无腺体基因转入到陆地棉中，首次培育出了显性无腺体陆地棉新种质。目 前已有20多个低酚棉品种通过省级以上审定并命名。低酚棉的种仁棉酚含量达到国家食 用标准（< 0? 02% )和国际食用标准（< 0? 04% )，但是针对低酚棉的品种，还没有建立起 精确的鉴定技术和方法。
【发明内容】
[0006] 本发明主要解决的技术问题是提供一种鉴定低酚棉花品种的方法，通过构建低酚 棉品种指纹图谱，开发一套鉴定低酚棉品种的分子标记，为区分和保护不同低酚棉品种提 供技术支持。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0008] -种鉴定低酚棉花品种的方法，包括如下步骤：提取各供试材料的基因组DNA，在 棉花26个连锁群上分别选择3条SSR引物，以各供试材料的基因组DNA为模板进行PCR扩 增，分析PCR扩增结果，构建各低酚棉花品种的指纹图谱，筛选出不同品种的特征引物，其 中有53对引物在不同供试材料间表现出稳定的多态性，利用最少2对特征引物组合即可 将低酚棉品种区分开来；所述的53对引物分别为：NAU4044、NAU5499、JESPR304、NAU5384、 NAU2161、BNL3441、NAU3469、NAU3386、NAU5015、NAU2121、NAU5434、NAU3206、NAU3654、 BNL1604、NAU3964、BNL3255、NAU5318、BNL2590、BNL256、HAU2681、HAU2837、NAU3897、 NAU3778、NAU5204NAU4863、NAU2765、NAU3736、JESPR243、NAU3733、NAU3714、BNL3955、 NAU2907、NAU2162、BNL448、NAU2894、BNL852、NAUl221、BNL3806、BNL827、NAU3906、NAU2734、 NAU2240、NAU5379、NAU5350、BNL3383、NAU5359、NAU3434、NAU4855和HAU2631，详见表1。
[0009] 表1 53对引物
[0010]
[0012] 前述鉴定低酚棉花品种的方法中，步骤（1)中所述的供试材料为我国审定的低酚 陆地棉品种9份，分别是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18号、辽棉11号、中棉所18、中棉 所20、汾低99和苏研608,以及低酚海岛棉海1和有酚陆地棉品种泗抗1号作为对照品种。
[0013] 前述鉴定低酚棉花品种的方法中，所述的指纹图谱的构建方法为：将对照种的扩 增带型记为1，后续泳道中遇到与其带型一致的记为1，不一致的记为2,遇到与带型2不一 致的记为3,依次类推。获得供试品种SSR引物扩增的基因型代码后，将所有引物扩增基因 型代码串联，按染色体号从小到大，先At亚组后Dt亚组的顺序依次排列，作为每一个品种 的数字指纹。
[0014] 前述鉴定低酚棉花品种的方法中，提取基因组DNA的方法为：
[0015] (1)将5g冻叶或鲜叶放入预冷的研钵中，加入液氮研磨，分2次加入IOml新鲜配 制的提取缓冲液，转入50ml的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min，4°C下4000rpm离心 20min，弃上清；
[0016] (2)于沉淀中加入15ml65°C预热的裂解缓冲液，并用铜丝搅松，涡旋混匀，65°C 水浴30min;
[0017] (3)加入15ml体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液，翻转50次以上，15 °C下 4000rpm离心20min，将上清转入50ml的离心管中，加0. 6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转 30次，混勾，静置10min，4000rpm，室温下离心lOmin，弃上清，于沉淀中加入2ml70%的乙 醇洗涤，并转入IOml的离心管中，1000 Orpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min;
[0018] (4)加3mlTE缓冲液，溶解，65°C培养10~30min，加3ml的体积比为24 : 1的 氯仿和异戊醇混合液，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，1000 Orpm离心IOmin;
[0019] (5)上清液转入IOml离心管中，加0? 1体积的pH为5. 2的3M醋酸钠，加等体积的 异丙醇后翻转30次，放置30min，1000 Orpm离心5min，弃上清液，加2ml70 %乙醇洗DNA小 团，1000 Orpm离心5min。倒掉上清液，通风干燥20min;
[0020] (6)加3mlTE缓冲液溶解，65°C培养10~30min;
[0021] (7)加5yI10mg/ml的RNAaseA，37°C温育30~60min。加等体积的体积比 为24 : 1的氯仿和异戊醇混合液，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min，1000 Orpm离心 IOmin；
[0022] (8)上清液转入IOml离心管中，加0. 1体积的pH为5. 2的3M醋酸钠，加等体积的 异丙醇后翻转30次；
[0023] (9)将絮状沉淀挑入加有800y1 70%乙醇的I. 5ml的离心管中，1000 Orpm离心 5min。弃上清液，自然通风干燥DNA小团；
[0024] (10)加200yITE缓冲液在4°C下溶解DNAl~2天，-20°C保存；
[0025] (11)以5y1北京天根IOObpDNALadder作为对照，将DNA依次稀释5倍、10倍 和20倍，通过1 %琼脂糖凝胶电泳，确