一种快速检测羊水中胎儿细胞vhl基因突变的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，尤其涉及羊水胎儿细胞VHL基因突变检测的方法和试 剂盒。
【背景技术】
[0002] VHL基因（M頂编号608537)定位于3p25-26,全长10KD，包含三个外显子和两个内 含子，可转录形成两种mRNA。包含三个外显子转录产物的mRNA翻译出p30 (213个氨基酸） 和pl9 (159个氨基酸）蛋白。pl9是VHL基因第二转录起始位点（54号密码子）转录形成 的异构体，与p30功能相似。
[0003] VHL基因突变方式多样，包括点突变、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位点突 变等。目前检测VHL基因突变最常用的方法是PCR直接测序，准确率为38 %~80 %，这是 由于PCR测序检测技术只能检测点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变，不能检测VHL 基因大片段缺失，然而VHL大片段缺失的发生率为11%~40%。目前国内外用于VHL基因 大片段缺失检测的方法包括印记杂交法SouthernBlot、多重连接探针扩增技术MLPA、逆转 录法RT-PCR及通用引物荧光定量PCR法UPQFM-PCR等。SouthernBlot和MLPA具有检测 方法操作繁琐，价格昂贵，不适于推广应用等缺陷，且上述VHL基因突变的检测样本多为外 周血，目前还没有对羊水中胎儿细胞的VHL基因进行检测的方法，一方面由于提取羊水时， 羊水中可能会受到母体遗传物的污染，影响检测结果；另一方面，目前的应用于外周血等检 测样本的VHL基因检测方法，检测周期长，检测成本高，不利于VHL基因的快速准确的检测。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种操作简单、检测 快速、结果准确且成本低廉的胎儿细胞VHL基因突变检测方法和试剂盒。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种快速检测羊水中胎儿细胞VHL基因 突变的方法，包括：
[0006] 通过提取羊水中胎儿细胞的DNA，获得DNA溶液；
[0007] 对所述的DNA溶液进行母体遗传物质污染的检测，判断DNA溶液中是否存在母体 遗传物质污染；
[0008] 若判断DNA溶液中不存在母体遗传物质污染，则直接对胎儿细胞进行VHL基因突 变检测；
[0009] 若判断DNA溶液中存在母体遗传物质污染，则对羊水中胎儿细胞进行培养传代后 再进行VHL基因突变检测。
[0010] 其中，所述母体遗传物质污染检测包括：
[0011] 人工合成人类性别决定基因SRY和X染色体上的3个短串联重复序列DXS6797、 DXS6807、AR的扩增引物对1-4 ;
[0012] 利用所述扩增引物对1-4和所述DNA溶液建立PCR扩增反应体系，进行PCR反应， 得到PCR扩增产物；
[0013] 对所述PCR扩增产物中的SRY基因扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，对所述 PCR扩增产物中的DXS6797、DXS6807和AR基因的扩增产物进行STR分析，根据所述SRY基 因扩增产物的电泳结果和STR分析结果判断所述DNA溶液中是否存在母体遗传物质污染。
[0014] 其中，所述利用所述扩增引物对1-4和所述DNA溶液建立的PCR扩增反应体系是： 总体积为25y1，包括12. 5y1的PCRmix、20-80ng的DNA模板、0. 5y1的扩增引物和余量 的CldH2O;反应条件是：在95°C温度条件下预变性5min;95°C变性20s，SRY基因、DXS6797、 DXS680755°C退火 20s，AR58°C退火 20s，72°C延伸 20s，30 个循环后 72°C复性 5min，4°C保 存。
[0015] 特别是，所述扩增引物对1-4如SEQIDNO. 1-8所示，分别为：
[0024] 其中，所述扩增引物对2中DXS6797-F引物的5'端标记FAM荧光。
[0025] 其中，所述扩增引物对3中DXS6807-F引物的5'端标记FAM荧光。
[0026] 其中，所述扩增引物对4中AR-F引物的5 '端标记FAM荧光。
[0027] 其中，所述VHL基因突变检测包括：
[0028] 采用荧光原位杂交探针对所述羊水中胎儿细胞进行VHL基因大片段缺失的检测， 获得所述胎儿细胞是否存在大片段缺失的检测结果。
[0029] 特别是，所述荧光原位杂交探针上标有荧光信号，由具有SEQIDNO. 15-20所示的 碱基序列的探针引物对8-10进行PCR制备得到。
[0030] 其中，所述探针引物对8-10如SEQ
ID NO. 15-20所示的碱基序列，包括：
[0037] 其中，所述由具有SEQIDNO. 15~20所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备 得到的杂交探针的大小为300_1000bp。
[0038] 进一步优选地，所述由具有SEQIDNO. 15~20所示的碱基序列的探针引物进行 PCR制备得到的杂交探针的大小为300-800bp。
[0039] 进一步优选地，所述由具有SEQ ID NO. 15~20所示的碱基序列的探针引物进行 PCR制备得到的杂交探针的大小为300-500bp。
[0040] 其中，所述采用荧光原位杂交探针对所述胎儿细胞进行VHL基因大片段缺失的检 测包括：
[0041] 利用已采集的羊水中胎儿细胞制备细胞涂片；
[0042] 将所述荧光原位杂交探针置于杂交液中与所述细胞发生杂交反应，获得杂交产 物；
[0043] 洗涤所述杂交产物，并进行细胞核染色，获得核染色后的细胞涂片；
[0044] 通过荧光显微镜观察所述核染色后的细胞涂片，判断待测样本的DNA是否发生了 VHL基因大片段缺失。
[0045] 其中，所述利用已采集的羊水中胎儿细胞制备细胞涂片还包括：对采集得到的羊 水中胎儿细胞进行培养传代。
[0046] 特别是，所述对羊水中的细胞进行培养传代是指在预先配制的胎儿细胞培养液中 进行培养传代，其中培养温度为37°C，空气中0)2的体积百分比为5%。
[0047] 特别是，所述胎儿细胞培养液由70-79%的hyclonedmem/fl2培养基、20-28%胎 牛血清FBS和1-2%的青霉素和链霉素双抗PS配制而成。
[0048] 优选地，所述胎儿细胞培养液由74%的hyclonedmem/fl2培养基、25%胎牛血清 FBS、1 %的青霉素和链霉素双抗PS配制而成。
[0049] 其中，所述制备细胞涂片的步骤包括：通过离心获得待测样本中的细胞，经磷酸盐 缓冲液离心和KCl低渗处理后，用固定液固定所述细胞的形态，制成细胞涂片；将所述细胞 涂片进行老化处理，经胃蛋白酶消化处理后，进行酒精梯度脱水，得到细胞涂片。
[0050] 其中，所述固定液是由体积比为3:1的甲醇和冰醋酸配制而成。
[0051] 其中，所述杂交液是是由体积比为5:1:1:3的甲酰胺、20xSSC、硫酸葡聚糖和水配 制而成。
[0052] 其中，所述老化处理是将所述细胞涂片在56°C条件下在烤片机上处理20min。
[0053] 其中，所述老化处理还可以是在15_30°C的室温条件下过夜放置12_16h。
[0054] 特别是，所述采用荧光原位杂交探针对所述胎儿细胞进行VHL基因大片段缺失的 检测还包括：荧光原位杂交探针的制备。
[0055] 其中，所述荧光原位杂交探针的制备包括：在人类基因组中筛选用作FISH探针的 VHL基因序列，通过克隆引物对11-13获得目的基因片段；将得到的基因片段连接到质粒 中，获得含有目的基因片段的质粒；将所述质粒在大肠杆菌中进行扩增，提取质粒后，得到 质粒溶液；利用探针引物对8-10、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧光 原位杂交探针。
[0056] 其中，所述克隆引物对11-13如SEQIDNO. 21-26所示的碱基序列，包括：
[0063] 其中，所述通过克隆引物对11-13获得目的基因片段的反应体系是
[0064] 反应物体积
[0065]PCRmix25U1
[0066]DNA模板IOOng
[0067]引物2yl
[0068] ddH20 余量
[0069] 总体积 50U1。
[0070] 其中，所述通过克隆引物对11-13获得目的基因片段反应条件是：94°C预变性 lOmin，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，30 个循环，72°C复性 7min，4°C保存。
[0071] 其中，所述将得到的基因片段连接到质粒中的反应体系是：T-vector0. 7y1，PCR 产物 5yI，T4 连接酶IyI，T4ByfferIyI，CldH2O余量，总体积 10y1。
[0072] 其中，所述将得到的基因片段连接到质粒中的反应条件是：在室温条件下反应 2h〇
[0073] 其中，所述利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧 光原位杂交探针的反应体系为：
[0076] 其中，所述利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧 光原位杂交探针的反应条件为：94°(：预变性21^11，94°(：变性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸 458,30个循环，72°(：复性1〇111111，4°(：保存。得到荧光原位杂交探针。
[0077] 其中，所述荧光原位杂交探针的浓度是约8_20ng/ y 1。
[0078] 优选的，所述荧光原位杂交探针的浓度是约10_15ng/ y 1。
[0079] 其中，所述杂交反应的共变性温度是70_80°C，共变性反应时间是5-10min。
[0080]优选地，所述杂交反应的共变性温度是73-76°C，共变性反应时间是7-8min。
[0081] 其中，所述杂交反应的杂交温度是40-46°C，杂交时间是14-18h。
[0082]优选地，所述杂交反应的杂交温度是42-44°C，杂交时间是16h。
[0083] 其中，所述VHL基因突变检测还包括：
[0084] 采用VHL基因的三个外显子VHL-UVHL-2和VHL-3的扩增引物对5-7对所述DNA 溶液进行VHL基因点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测，获得所述DNA溶液中 是否存在点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变的检测结果。
[0085] 其中，所述VHL基因的三个外显子VHL-I、VHL-2和VHL-3的扩增引物对5-7如SEQ IDNO. 9-14所示，分别为：
[0092] 尤其是，所述采用VHL基因的三个外显子VHL-1、VHL-2和VHL-3的扩增引物对所 述D