人类免疫缺陷病毒hiv-1的定量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及诊断技术领域，特别是涉及一种人类免疫缺陷病毒Hiv-I的定量检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] HIV感染可以通过检测病毒的抗体、抗原、核酸来确定。目前，常用的检测方法是血 清学HIV抗体检测，它是诊断艾滋病病毒感染和艾滋病的主要指标和标准检测项目。
[0003] HIV病毒核酸检测原理是利用核酸检测的方法，直接检测HIV病毒的核酸RNA。 核酸检测具有快速、高效、敏感和特异等优点，在感染过程中，患者体内首先出现的是病毒 RNA，这时可以采用核酸检测的方法检测出来，之后出现的是IgM抗体，采用双抗原夹心法 检测出来，然后出现的是IgG抗体，使用间接法检测出来，因此，HIV病毒核酸检测技术的应 用使HIV病毒的检测"窗口期"由原来的22天缩短到11天。
[0004] 传统的HIV病毒的定量检测试剂盒通常需要从样本中提取纯化的核酸分子 (HIV-RNA)，而从样本中提取核酸的步骤操作复杂。
【发明内容】
[0005] 基于此，有必要提供一种不需要从样本中提取核酸就可以完成检测的人类免疫缺 陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒。
[0006] -种人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，包括：
[0007] 样本处理剂，包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、P_巯基乙醇和蛋白酶 K;
[0008] 用于靶核苷酸扩增的上游引物HIV-F;
[0009] 用于靶核苷酸扩增的下游引物HIV-R;
[0010] 用于革E核苷酸检测的Taqman探针HIV-P，所述Taqman探针Hiv-P的两端分别结合 有荧光基团和荧光猝灭剂；以及
[0011] RNA-步法反应缓冲液。
[0012] 在一个实施例中，所述样本处理剂用于与检测样本混合均匀后在55°C~70°C加 热IOmin~15min〇
[0013] 在一个实施例中，所述样本处理剂中，所述异硫氰酸胍的浓度为0. 2mol/L~ 2mol/L，所述梓檬酸钠的浓度为10mmol/L~30mmol/L，所述十二烷基肌酸钠的质量百分含 量为0.2%~1%，所述(6-巯基乙醇的浓度为0.05mol/L~0?lmol/L，所述蛋白酶K的浓 度为lmg/mL~5mg/mL〇
[0014] 在一个实施例中，所述上游引物HIV-F的序列为SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 2所 示的序列，所述下游引物HIV-R的序列为SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5或SEQ IDNo. 6所示的序列。
[0015] 在一个实施例中，所述Taqman探针HIV-P的序列为SEQIDNo. 7或SEQIDNo. 8 所示的序列。
[0016] 在一个实施例中，所述Taqman探针HIV-P的5'端结合有FAM，所述Taqman探针 HIV-P的3'端结合有BHQl。
[0017] 在一个实施例中，还包括HIV-I内标的RNA转录物和内标探针HIV-IC，所述HIV-I 内标的RNA转录物为HIV-I内标转录得到，所述HIV-I内标为克争性内标，所述内标探针 HIV-IC的两端分别结合有荧光基团和荧光猝灭剂。
[0018] 在一个实施例中，所述HIV-I内标的序列为SEQIDNo.9所示的序列。
[0019] 在一个实施例中，所述内标探针HIV-IC的碱基序列序列为SEQIDNo. 10所示的 序列，所述内标探针HIV-IC的5'端结合有HEX，所述内标探针HIV-IC的3'端结合有BHQl。
[0020] 在一个实施例中，还包括HIV-I定量参考品、HIV-I阳性对照和HIV-I阴性对照。
[0021] 这种人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒在进行检测时，直接将检测样本 与样本处理剂混合处理后即可用于后续检测。相对于传统的HIV病毒的定量检测试剂盒， 这种人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒省略了从样本中提取纯化的核酸分子的 步骤，从而操作上更为省时、简单。
【附图说明】
[0022] 图Ia为实施例1优化反应体系和反应条件前的荧光检测结果图；
[0023] 图Ib为实施例1优化反应体系和反应条件后的荧光检测结果图；
[0024] 图2a为实施例2中的对定量标准品进行梯度稀释后检测线性范围的荧光检测结 果图；
[0025] 图2b为实施例2中的对定量标准品进行梯度稀释后平行检测10管HIV-I载量为 100IU/mL模板的荧光检测结果图；
[0026] 图2c为实施例2中的对定量标准品进行梯度稀释后平行检测10管HIV-I载量为 50IU/mL模板的荧光检测结果图；
[0027] 图2d为实施例2中的对定量标准品进行梯度稀释后平行检测10管HIV-I载量为 25IU/mL模板的荧光检测结果图；
[0028]图3为实施例3中的对定量标准品进行梯度稀释后的进行精密度检测的荧光检测 结果图；
[0029] 图4a为实施例4中采用10份"HIV-1RNA国家标准品"中的阳性参考品的荧光检 测结果图；
[0030] 图4b为实施例4中采用正常人血清和其他血源性病原微生物的荧光检测结果图。
【具体实施方式】
[0031] 下面主要结合附图及具体实施例对人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒 做进一步的解释说明。
[0032] -实施方式的人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒，包括：样本处理剂、用 于靶核苷酸扩增的上游引物HIV-F、用于靶核苷酸扩增的下游引物HIV-R、用于靶核苷酸检 测的Taqman探针HIV-P以及RNA-步法反应缓冲液。
[0033] 样本处理剂包括异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌酸钠、P-巯基乙醇和蛋白酶 K0
[0034] 样本处理剂用于与检测样本混合均勾后在55°C~70°C加热IOmin~15min;其 中，样本处理剂与检测样本的体积比可以为2~1 :1。
[0035] 具体的，样本处理剂中，异硫氰酸胍的浓度为0. 2mol/L~2mol/L，柠檬酸钠的浓 度为lOmmol/L~30mmol/L，十二烷基肌酸钠的质量百分含量为0. 2%~1 %，-巯基乙醇 的浓度为〇? 〇5mol/L~0?lmol/L，蛋白酶K的浓度为lmg/mL~5mg/mL。
[0036] 本实施方式中，上游引物HIV-F、下游引物HIV-R和Taqman探针HIV-P是选取HIV 基因gag区的一段保守序列进行设计，由于HIV-I病毒亚型较多，基因序列变异复杂，上游 引物HIV-F和下游引物HIV-R均为简并引物。
[0037] 通常情况下可以将上游引物HIV-F、下游引物HIV-R和Taqman探针HIV-P直接溶 解在RNA-步法反应缓冲液中，上游引物HIV-F和下游引物HIV-R在RNA-步法反应缓冲 液中的终浓度均为〇? 2ymol/L~0? 4ymol/L，Taqman探针HIV-P在RNA-步法反应缓冲 液中的终浓度为〇? 05umol/L~0? 2umol/L。
[0038] 具体的，上游引物HIV-F的序列为SEQIDNo. 1或SEQIDNo. 2所示的序列，下游 引物HIV-R的序列为SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5 或SEQIDNo. 6 所示的序 列。
[0039]Taqman探针HIV-P的两端分别结合有荧光基团和荧光猝灭剂。
[0040] 具体的，Taqman探针HIV-P的5'端结合有FAM(羟基焚光素，Carboxyfluorescei n)，Taqman探针HIV-P的3 '端结合有BHQl(BLACKHOLEQUENCHER?系列非荧光染料）。 Taqman探针HIV-P的序列为SEQIDNo. 7或SEQIDNo. 8所示的序列。
[0041]RNA-步法反应缓冲液包括Tris-HCl、硫酸铵、氯化钾、硫酸镁和Tween20。具体 的，RNA-步法反应缓冲液中，Tris-HCl的终浓度为lOmmol/L~65mmol/L，硫酸铵的终浓 度为10mmol/L~20mmol/L，氯化钾的终浓度为40mmol/L~80mmol/L，硫酸镁的终浓度为 2mmol/L~5mmol/L，Tween20与RNA-步法反应缓冲液的体积比为0. 01~2 :100。
[0042] 本实施方式中，人类免疫缺陷病毒HIV-I的定量检测试剂盒还包括反应酶系，反 应酶系包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、BSA、逆转录酶和RNasin。
[0043] 具体地，反应酶系中，TaqDNA聚合酶的终浓度为0? 5U/yL~5U/yL，四种核苷酸 单体（dNTPs)的终浓度均为0? 2mmol/L，BSA的终浓度为0? 2mg/mL~0? 5mg/mL，逆转录酶 的终浓度为2U/yL~20U/yL，RNasin的终浓度为0? 2U/yL~IU/yL。其中，TaqDNA聚 合酶为改良的可抗抑制剂的TaqDNA聚合酶，逆转录酶为改良的可以提高逆转录效率和特 异性的逆转录酶。
[0044] 在其他的实施方式