一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用

文档序号:9390779阅读:962来源:国知局
一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用
【专利说明】一种对CHH具有结合活性的重组河蟹EsfIoI蛋白及应用
[0001] 本研究受到国家自然科学基金青年基金(31302168);天津市应用基础与前沿技术 研究计划(一般项目)(14JCYBJC30700);天津师范大学博士基金(52XB1303)的支持。
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域,具体是一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esf1〇1蛋 白及应用。
【背景技术】
[0003] 甲壳动物高血糖激素(CHH),是神经多肽激素家族的成员之一。该蛋白仅存在于节 肢动物中,在血淋巴葡萄糖水平调节、蜕皮以及应激过程中起着关键作用。虽然细胞膜上的 鸟苷酸环化酶(GC)已被公认为Y器官的CHH受体,但在肝胰脏中的受体仍然没有确定。在 本研究中,我们通过对河蟹转录组分析,筛选并克隆到了一个在去眼柄后表达量提高了 2. 8 倍的基因一中华绒螯蟹flotilin类似蛋白(Esflol)作为目标分子去研究。通过体外原核 表达系统,我们获得了重组flotilin蛋白。利用CHH与重组flotilin蛋白的Pull-down 实验以及大分子互作仪检测,我们发现CHH可以和floti1in直接结合。该结果是首次在甲 壳动物肝胰腺中发现的CHH结合蛋白,同时表明可以通过体外表达flotilin来调节CHH的 浓度。
[0004] 甲壳动物高血糖素(CHH)属于CHH神经肽家族。这个家族包含了一类结构相关的 多肽,包括蜕皮抑制激素(MIH),卵黄/精巢抑制激素(VIH/GIH),大腭器抑制激素(M0IH)以 及离子转运多肽(ITP)。所有这些成员都只在节肢动物中发现。
[0005] 学界广泛认为,CHH是能够调控几种生理活性的多效分子,如血糖水平,脂类代谢, 蜕皮与应激反应。第一次对CHH的描述是关于其对糖代谢的调控的。肝脏和肌肉是CHH的 主要靶标器官,肝脏在蜕皮过程中的所起到的作用是储存能量,肌肉亦是另一个糖原的储 存场所。学者们认为,CHH在对下游分子的调节机理上在肝脏和肌肉这两种器官中是明显 不同的。肌肉的糖原只供给其自身,相比之下肝脏所合成与储存的糖原是供给全身的。
[0006] 在外界环境的胁迫下,机体中糖原的变化和总碳水化合物的变化总是伴随着CHH 的分泌量的变化。当剪去斑节对虾和罗氏沼虾的眼柄后,糖原磷酸化酶明显下降而糖原合 成酶的明显上升,这预示着去除眼柄能够促进糖原的积累。另外,肝胰腺在含CHH溶液中的 浸泡能够使得葡萄糖转化为糖原的比例降低。综合这些得到的证据表明CHH确实是参与肝 脏的糖原代谢的,但CHH的受体以及信号传导通路还是不明确。在甲壳动物中,已经明确的 证实了当减去眼柄之后,肝脏的细胞内cGMP水平会显著下降,而不是cAMP。也即表明,在甲 壳动物中蛋白激酶G替代了蛋白激酶A参与到了CHH介导酶激活系统。但是细胞膜表面直 接和CHH作用的分子依然悬而未决。
[0007]flotilins被认为是定位在细胞膜表面脂後(lipidraft)上的连接性蛋白。除此 之外,它们能分布在细胞内体,吞体,高尔基体甚至细胞核,直到现在,关于flotilins是 否只在质膜上存在还没有定论。
[0008] 在flotilin家族中存在两种同源异构体,flotilinl和flotilin2。一般认为, 这两类蛋白会相互结合形成异源多聚体,并参与到一些细胞活动中,如轴突再生,膜蛋白更 新,以及内吞作用等等。虽然flotilin在种间进化上十分保守,但它的确切功能依然存在 较大的争议并需要进一步的证据来证明许多的推断。最早,在金鱼的视网膜细胞轴突再生 的研究中发现了flotilin,当时被命名为再生reggies。敲除floti1ins可显著减弱机体对 胆固醇的吸收,这意味着它在NPC1L1介导的胆固醇吸收机制中起着关键的作用。在T细胞 中,flotilins被定位在细胞的一端,形成一个flotilin帽子结构,这个结构能够激活PrPe 导致主要的T细胞受体复合体CD3的回收,而连接这一受体和一类信号分子如Vav的通路 也被人们发现。也就是说,flotilin形成的亚结构能作为T细胞的信号平台。
[0009] 据推测,在细胞某些特定位置的Flotilins能够参与细胞膜以及膜表面蛋白的更 新。在脂肪细胞,Flotilins能够从细胞深层将GLUT4回收到细胞表面。一些数据还支持 说Reggie/flotilin蛋白能在细胞相互接触的区域参与信号过程。
[0010] 作为理解甲壳动物中Flotilin类似蛋白功能的第一步,我们找到了一个了河蟹 AshMirflotilin类似基因,命名为Esflol。在本研究中,我们对Esflol进行了原核表 达,并检测了其与CHH的结合能力。结果显示,Esflol能和CHH特异结合。

【发明内容】

[0011] 本发明公开了一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白,其特征在于该 蛋白具有426个氨基酸,如SEQIDNO. 1所示,编码的蛋白理论等电点为9. 150,分子量为 47. 18kD;该蛋白具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列,所对应的基因序列中开放阅读框 (0RF)全长 1281bp。
[0012] 本发明进一步公开了一种表达中华绒螯蟹Esflol的特异性引物,具有如下的核 苷酸序列: Fl:5 '-AATTCCATATGATTCCCATTTTCATCA-3' ; R1:5 '-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3 '。
[0013] 本发明更进一步公开了对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白在和CHH特 异结合,缩短中华绒螯蟹的生长期,加快其生长发育治疗方面的应用。其中缩短中华绒螯蟹 的生长期指的是提高河蟹肝胰腺糖原累积。实验结果证实: (1)本发明,证明CHH能够与Esflol产生特异性结合作用。
[0014] (2)本发明证实Esflol能够作为CHH的受体参与CHH对河蟹血糖水平的调控。
[0015] 本发明公开的对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用所具有的积极 效果在于: (1)能够缩短养殖产业上中华绒螯蟹的养殖周期,实现养殖户利润的最大化。
[0016] (2)提高养殖河蟹的平均重量,增加亩产。
[0017] (3)提升熟蟹肝胰腺的营养价值和风味。
[0018] 本发明所筛选的核苷酸及氨基酸序列如下: SEQIDNO. 1所示的Esflol核苷酸序列: ATGATTCCCATTTTCATCACGTGTCCGCCCAATGAAGTCCTGGTGGTGTCTGGCCTCGGGTTCACGCAGCC AGCCATGATCACTGGAGGCCGCGTGCTCGTCGTGCCCGGCCTGATGAGATGGAGCAGACTGTCCCTGAACGTTCGC

【附图说明】: 图1质粒PET30_Esflol转化至Rosetta菌株后PCRinsertcheck电泳结果; 图2Esflol中稀有密码子检测情况(灰色部分表示稀有密码子的种类及数量) 图3PET30-Esflol与空白PET30诱导表达以及破碎纯化SDS-PAGE检测结果; 图 4CHH抗体WesternBlot检测Pull-down各组分:1.T1 实验组,Bait:CHH,Prey:Esflol; 2.Cl对照组,Bait:Washsolution,Prey:Esflol;3.C2 对照组Bait:CHH, Prey:Washsolution; 图5WesternBlot检测EsflolPull-down结果(以膜蛋白提取物为阳性对照)Pull-downEsflol组,Bait:CHH,Prey:Esflol;ControlEsflol组,膜蛋白; 图6WesternBlot检测EsflolPull-down结果(以原核表达蛋白样品为阳性对照)Pull-downEsflol组,Bait:TBS,Prey:rEsflol;ControlEsflol组,rEsflol; 图7CHH与Esflol互作结果分析。
[0019] 【具体实施方式】: 下面结合实施例说明本发明,这里所述实施例的方案,不限制本发明,本领域的专业人 员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化,所述的这些改进和变化都应视为在本发明 的范围内,本发明的范围和实质由权利要求来限定;其中所用试剂均有市售;
实施例1 中华绒螯蟹Esflol的原核表达与纯化 原核表达载体为PET-30vector,表达菌株为Rosetta菌株。Etaq酶,DNAmarker DL2000,pMD19_Tvector,NdeI,EcorI,DNALigationkit均购自TaKaRa公司;琼脂糖、 SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、LB固体培养 基、LB液体培养基、异丙醇、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、甘氨酸、EDTA、SDS、TEMED、 Acrylamide(40%)、过硫酸胺、考马斯亮蓝R-250、溴酚蓝、Tris等试剂均购自上海生工生物 工程有限公司;蛋白marker购自Fermentas公司;其他试剂均为国产分析纯。
[0020] 1. 1表达载体的构建 (1)设计PCR引物 Fl:5 '-AATTCCATATGATTCCCATTTTCATCA-3' ; R1:5 '-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3 ', 上游引物添加Ndel酶切位点,下游引物加6个His密码子和Ecorl酶切位点。以中华 绒螯蟹肝胰腺组织cDNA为模板进行PCR,反应体系及程序如下:
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,进行测序。
[0021] (2)以PET30vector为表达载体,Rosetta为
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