一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酪蛋白多肽领域，尤其涉及一种小分子酪蛋白多肽及制备领域。
【背景技术】
[0002] 牦牛奶是优质的营养食品，但是又是较易引起过敏的食物之一。酪蛋白占牦牛奶 蛋白总量的80%，是牛乳中含量最高的蛋白质，也是牦牛奶5种具变应原性蛋白中，变应原 性最强的蛋白质。异性蛋白质，如酪蛋白，由于其分子量过大，进入体内后，未发育成熟的 婴儿胃肠缺乏分解它们的酶，便作为抗原进入血液循环，刺激人体产生抗体，从而引起过敏 反应，如腹痛、腹胀或腹泻、哮喘、荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎、大便常带粘液和血等过敏等症 状。这些症状会给婴幼儿带来很大的痛苦。
[0003] 小分子蛋白质或多肽就不会诱发免疫变态反应。但是，小分子蛋白质往往会失去 原形蛋白质的营养和功效。而且，氨基酸本身的味道较苦，分解越充分、纯度越高的氨基酸 味道越苦，因此，会影响口感。如何才能让分解后的小分子蛋白质既有营养，口感又好，一直 是一个难以协调的问题。
【发明内容】
[0004] 发明目的
[0005] 针对现有牦牛奶乳制品的现状，发明一种小分子酪蛋白多肽，该多肽既有酪蛋白 的营养，而且对婴幼儿不易产生变态反应，口感又好的食品添加剂。
[0006] 技术方案
[0007] 本发明为一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽，其序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。 其制备步骤包括（1)将牦牛奶1L与50-100ml凝乳酶混合，离心2000-3000rpm，5-10分 钟，得到凝固沉淀物；（2)将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心2000-3000rpm，5-10分钟， 取上清；（3)将上清液加入pH4-5的酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分 钟，得到沉淀物；⑷将沉淀物溶于PH4. 5-5. 0缓冲液中，经S印hadexG25分离出分子量为 2-3KDa的多肽，即得。所述的凝乳酶，可以是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜 蛋白酶、合欢蛋白酶、朝鲜蓟蛋白酶等。
[0008] 有益效果
[0009] 本发明的制备得到的小分子牦牛奶酪蛋白多肽，经蛋白质序列测定，序列为 PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，纯度大于60%。药理实验表明，该小分子多肽能显著促进 Ca、Mg等微量元素的吸收，作用与酪蛋白相当。抗原实验结果表明，该小分子多肽没有抗原 性。由于该多肽为小分子多肽，而不是氨基酸，因此口感较好。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1
[0011] 将牦牛奶1L与50ml木瓜蛋白酶混合，离心2000rpm，5分钟，得到凝固沉淀物；将 凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心2000rpm，5分钟，取上清；将上清液加入pH4-5的酸性缓 冲液中，搅拌，离心lOOOOrpm，30分钟，得到沉淀物；将沉淀物溶于pH4. 5-5. 0缓冲液中， 经S印hadexG25,pH7. 2的PBS缓冲液作为流动相，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即 得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，纯度为 87%〇
[0012] 实施例2
[0013] 将牦牛奶1L与100ml合欢蛋白酶混合，离心3000rpm，10分钟，得到凝固沉淀物； 将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心3000rpm，10分钟，取上清；将上清液加入pH4-5的酸性 缓冲液中，搅拌，离心15000rpm，60分钟，得到沉淀物；将沉淀物溶于pH4. 5-5. 0缓冲液中， 经S印hadexG25,pH7. 2的PBS缓冲液作为流动相，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即 得。采用固相蛋白质自动测序仪测定该多肽的序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，纯度为 76%〇
[0014] 实施例3
[0015] 免疫原性检测：BALB/c白鼠6只，雌雄各半，口服分别给予36mg/kg的实施例1制 备得到的多肽。连续给药8周，于1-12周眼眶静脉丛定点取血每周一次，12000rpm离心 2min，分离血浆取上清液，-20°C低温保存备用。待室温溶解后，取0. lml上清液间接ELISA 检测血清中抗体滴度，其中所述的ELISA检测试剂盒购自上海生工。以各样品实际A值 (0D450)比阴性对照血清A值即得RA值，RA彡2. 1即为阳性，将Blood bio-samples样品 作一系列稀释后进行检测，呈阳性反应的最高稀释度即为该样品的滴度。测定结果显示。 1-12周收集的血样，经ELISA间接法检测多肽诱导抗体的RA均小于1. 5,均为阴性。由此 可见，本发明得到的小分子牦牛奶酪蛋白多肽无免疫原性。
[0016] 实施例4
[0017] 血清中钙离子的含量：ICR白鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，每组10只，分别 为空白组、牦牛奶组、酪蛋白多肽低、高剂量组，分别口服生理盐水、牦牛奶、酪蛋白多肽9， 36mg/kg。连续给药4周，于第四周末次给药后眼眶静脉丛定点取血测血清中钙含量。
[0018] 结果：如表1，酪蛋白多肽低、高剂量组均能显著性升高血清中钙离子的含量 (P〈0. 05)，与牦牛奶组相比无差异。
[0019] 表1小分子牦牛奶酪蛋白多肽对血清f丐离子含量的影响（means土s)
[0020]
[0021] #p〈0.05模型组相比。
【主权项】
1. 一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽，其特征在于，序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。2. 根据权利要求1所述小分子牦牛奶酪蛋白多肽的制备方法，其特征在于，步骤包括 (1) 将牦牛奶IL与50-100ml凝乳酶混合，离心2000-3000rpm，5-10分钟，得到凝固沉淀物； (2) 将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（3)将上清液加 入PH4-5的酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；（3)将沉 淀物溶于pH4. 5-5. 0缓冲液中，经S印hadex G25,分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。3. 根据权利要求书2小分子牦牛奶酪蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的凝乳 酶是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、生姜蛋白酶、合欢蛋白酶或朝鲜蓟蛋白酶。
【专利摘要】本发明公开了一种小分子牦牛奶酪蛋白多肽，主要涉及一种小分子酪蛋白多肽及制备领域。其序列为PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ。其制备步骤包括（1）将牦牛奶1L与50-100ml凝乳酶混合，离心2000-3000rpm，5-10分钟，得到凝固沉淀物；（2）将凝固沉淀物加入水中，煮沸，离心2000-3000rpm，5-10分钟，取上清；（3）将上清液加入pH4-5的酸性缓冲液中，搅拌，离心10000-15000rpm，30-60分钟，得到沉淀物；（4）将沉淀物溶于pH4.5-5.0缓冲液中，经Sephadex？G25，分离出分子量为2-3KDa的多肽，即得。本发明的有意效益在于制备得到的多肽纯度大于60%，能显著促进Ca、Mg等微量元素的吸收，作用与酪蛋白相当，无抗原性，口感较好。
【IPC分类】C07K14/47, C07K1/30, C12P21/06
【公开号】CN105111298
【申请号】CN201510548625
【发明人】叶亚东, 叶季峨
【申请人】常州亚当生物技术有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月31日