一种固液结合制备利拉鲁肽的方法

文档序号:9390785阅读:658来源:国知局
一种固液结合制备利拉鲁肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽药物制备方法领域,特别涉及一种固相和液相结合制备利拉鲁肽 的方法。
【背景技术】
[0002] 利拉鲁肽(Liraglutide),商品名Victoza,由丹麦诺和诺德公司研发,于2010年 1月25日在美国上市,2011年3月4日获SFDA批准,进入中国市场;用于成人2型糖尿病 患者控制血糖,适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳 的患者,与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。2014年12月23日,诺和诺德公司又推出用于 治疗肥胖的Saxenda(商品名),剂量为3mg/天。
[0003] 利拉鲁肽是一种GLP-1类似物,与人GLP-1具有97%的序列同源性,人GLP-1可以 结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点,GLP-1是一种内源性肠促胰岛素 激素,能够促进胰腺0细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与天然GLP-1不同的是,利 拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给 药后,其作用时间延长的机理包括:使吸收减慢的自联作用;与白蛋白结合;对二肽基肽酶 IV(DPP-IV)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性,从而具有较长的血浆半衰期。
[0004]利拉鲁肽化学表述为Arg34Lys26_[N_e- (y_Glu(N_a-十六酰基))]-GLP_l7 37,分 子式为C172H265N43051,相对分子质量为3751. 2,CAS号为204656-20-2,序列信息如下:
目前,诺和诺德公司(US6458924和US6268343)主要通过基因重组技术,利用酵母生 产利拉鲁肽;但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg34-GLP_17 37,还需要和N-a-十六 酰基-Glu(OSu) -OtBu反应,利用化学方法在Lys26接上侧链;由于Arg34-GLP-l7 37的侧链均 未保护,存在多个活性位点,所以此过程会产生较多杂质,损失较大。
[0005] 还有报道采用固相化学法制备利拉鲁肽,主要集中在侧链修饰的连接策略上:如 专利CN102286092A采用Fmoc-Lys(Alloc)-〇H参与接肽反应,Pd(PPh)J^Alloc,然后连 接侧链;CN103087181A采用Fmoc-Lys(Mtt)-〇H或Fmoc-Lys(Mmt)-〇H参与接肽反应,用 1%TFA/5%TIS/DCM脱侧链保护基,连接侧链;CN103145828A采用Fmoc-Lys(ivDde)-〇H参 与接肽反应,水合肼脱侧链保护基,然后接侧链反应;CN103980358A采用先液相合成单体 Fmoc-Lys(N-e- (y-Glu(N-a-十六酰基)-OtBu) -0H,然后参与接肽反应;CN103275209A 采用先合成N端保护的利拉鲁肽主链,然后在液相条件下,用Na -Pal-y-Glu(OtBu) -OSu与 之发生偶联反应,然后经酸TFA脱叔丁基,碱性条件下脱Fmoc或Dde(或ivDde)两步后处 理,再经纯化得到利拉鲁肽。
[0006] 本发明人用现有的合成方法,制备利拉鲁肽,发现纯度和收率均不高,不适于工业 规模生产。鉴于以上问题,本发明人对利拉鲁肽的合成方法进行了研究,从而得到本发明的 技术方案。

【发明内容】

[0007] 为了解决现有技术的不足,本发明提供一种利拉鲁肽的固相和液相相结合的制备 方法。
[0008]本发明中利用合成的二肽单体Fmoc-Lys (N-e- (y-Glu (N_Boc)-OtBu)-OH和 Fmoc-Ala-Ala-OH参与制备利拉鲁肽,并采用三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)模式,极大 的提高了终产品的收率;本发明降低合成难度和生产成本,提高了精肽的纯度和收率,有利 于规模化工业生产。本发明一种固液结合制备利拉鲁肽方法的技书方案包括如下步骤: (a) Boc-Glu (OSu)-OtBu和Fmoc-Lys-OH在喊性溶液下偶联生成二肽单体Fmoc-Lys (N-e-(y-Glu(N-a -Boc)-OtBu)-OH ; (b) 以Wang树脂或CTC树脂为固相载体,采用Fmoc化学保护策略,按照利拉鲁肽肽序, 依次与Fmoc保护氨基酸合成N端三氟乙酰化的全保护肽树脂,其中Fmoc保护氨基酸26位 Lys采用的是单体Fmoc-Lys(N-e- (y-Glu(N-a-Boc) -OtBu) -0H,24 位和 25 位采用二肽单 体Fmoc-Ala-Ala-〇H;N端三氟乙酰化的全保护肽树脂结构如下:Tfa-His(Trt) -Ala-Glu(0 tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu) -Val-Ser(tBu) -Ser(tBu)-Tyr( tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N_e-(丫 -Glu(N_a-Boc) -OtBu)-Glu (OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)_Gly-树脂; (c) 用裂解试剂裂解肽树脂得到三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰),并经纯化,得到 精肽:Tfa-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln -Ala- Ala -Lys(y-Glu - OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg- Gly-〇H; (d) 在碱性条件下,Pal-OSu与步骤(c)所得三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)精肽 发生偶联反应,得到棕榈酸修饰的产物; (e) 经碱解、纯化、冻干得到利拉鲁肽。
[0009]其中以上步骤(a)中Fmoc-Lys(N-e_(y-Glu(N-a-Boc)-OtBu)-0H的具体合成 方法为: 将Fmoc-Lys-〇H或其盐与碱A按照摩尔比1:1~2的比例溶解在水中,加入5~20% 体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后,搅拌下滴加入1~1. 2倍摩尔量(以Fmoc-Lys-OH 的量计)Boc-Glu(OSu)-OtBu的有机溶剂B溶液;TLC监测反应终点,待反应结束减压蒸 发去掉有机溶剂后,再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2~3,乙酸乙酯萃取,析晶得 Fmoc-Lys(N-e-(y-Glu(N-a-Boc)-OtBu)-〇H〇
[0010] 以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基 二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种; 有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙 腈中的一种或几种。
[0011] 以上技术方案步骤(b)中N端三氟乙酰化的全保护肽树脂的具体制备方法为:以 Wang树脂或CTC树脂为固相载体,以2-5倍的投料比(以合成规模的物质量计),加入相应 的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应,每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接 肽反应,反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc,再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应; 重复操作直至合成至1位His后,用三氟乙酸酐封端,得到N端三氟乙酰化的全保护肽树 脂Tfa-His(Trt)-Ala_Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)_Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt) -Ala-Ala-Lys(N_e- (丫 _Glu(N_a-Boc)-〇tBu) -Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val_Arg (Pbf)-Gly-Arg(Pbf)_Gly-树脂。其中26位Lys采用的Fmoc保护氨基酸为步骤(a)制得 的Fmoc-Lys(N-e- (y-Glu(N-a-Boc) -OtBu) -〇H,24 位和 25 位Ala米用Fmoc保护氨基 酸为二肽单体Fmoc-Ala-Ala-〇H;其他位点均采用常规的Fmoc保护氨基酸偶联。优选的, 步骤(b)中所述的Wang树脂或CTC树脂的替代度为0. 3-0. 5mmol/g;所述缩合剂为DIC/ HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种;脱保护 试剂为15~25% (体积含量)哌啶/DMF溶液。
[0012] 上述技术方案中步骤(c)中所述裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液, 所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和三异丙基硅烷中的一种或 几种。
[0013] 上述技术方案中步骤(d)的具体操作步骤为: 取步骤(c)所得精肽与碱A按照摩尔比1:4~6的比例溶解在水中,加入体积比5~ 20%的有机溶剂B助溶,待完全溶解后,搅拌下滴加入1~2. 0倍摩尔量(以精肽的量计) Pal-〇Su的有机溶剂B溶液;继续搅拌反应,TLC监测反应终点;反应达到终点后,加入1~ 2. 0倍摩尔量的甘氨酸(以精肽的量计),终止反应。
[0014] 其中步骤(d)中所述的碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙 胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种;所述有机溶剂B为四氢呋喃、二氧 六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或几种。
[0015] 技术方案中步骤(e)中碱解的具体操作方法为:量取体积比10-12%的哌啶(以步 骤(d)所得的溶液体积计),加入步骤(d)所得的溶液中,配制成浓度为1M的哌啶溶液,搅 拌反应至三氟乙酰基碱解完全;然后经超滤装置脱盐,不断加入纯水稀释肽溶液,保持溶液 体积不变;当溶液pH值降至12~10时,采用0. 2-1. 0%醋酸水溶液稀释肽溶液,至pH值降 至5~6时,停止抽滤。
[0016] 相对于现有技术,本发明的有益效果是: 本发明首次合成二肽单体Fmoc-Lys (N-e-(y-Glu (N-Boc)-OtBu)-OH,并将其用于 利拉鲁肽的制备,其合成过程和纯化过程简单易行,便于中控检测,易于放大生产;同时采 用Fmoc-Ala-Ala-OH参与制备利拉鲁肽,避免了24位或25位缺失Ala杂质肽的生成,降低 了纯化难度,提高了收率;三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)水溶性较好,利于反相色谱 纯化制备,同时还保护了N端的氨基在棕榈酸修饰过程中不发生副反应,极大的提高了终 产品的收率;本发明的实施,解决了化学合成利拉鲁肽过程中终产品相关杂质肽超标、总收 率低的难题,终产品的纯度提高到99. 5%以上,单杂控制在0.
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