重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，属于重组人胰岛素的 制备领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染 性疾病。目前，中国糖尿病患病人数已取代印度成为世界第一，世界卫生组织（WHO)预测至 2025年全球糖尿病人数将突破3. 0亿。
[0003] 胰岛素制品是最有效的糖尿病治疗药物之一。随着科学技术的发展，从提取动物 胰岛素到有机合成胰岛素、半合成人胰岛素，到现如今占主要市场的重组人胰岛素，胰岛素 的工业化生产过程已经历了翻天覆地的变化。重组胰岛素前体分为包涵体和分泌蛋白两种 形式，分泌蛋白常使用阳离子层析柱，但在样品进行离子纯化前需要初步纯化，如中国专利 CN1854299A中提到，胰岛素前体在离子层析纯化前需要经过盐析或微滤步骤进行初步纯 化，样品处理程序复杂，操作繁琐，且工艺步骤的增多必然会导致样品收率的降低。
[0004] 因此，开发一种新的重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，使纯化后的重组 胰岛素前体直接进行酶切，简化生产工艺，将具有重要的市场价值和应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方 法，该方法经过一步离子层析纯化，能够将重组胰岛素前体纯度从14%提高至95%，且纯 化后的样品可直接进行酶切，酶切转换效率在95%以上，简化了生产工艺，节约纯化成本。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0007] 本发明公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法，包括：（1)将阳离 子离子层析柱用平衡液进行平衡；（2)将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清上平衡 后的阳离子离子层析柱，依次用平衡液进行平衡、用洗涤液进行洗涤和用洗脱液进行洗脱； 收集洗脱产物，得到纯化的重组人胰岛素前体；（3)将纯化的重组人胰岛素前体用胰蛋白 酶进行酶切转换，得到缺少B链第30位苏氨酸的人胰岛素；其中，所述洗脱液的pH值为 7. 0-9. 0,优选为 7. 8-8. 5,更优选为 8. 0-8. 5。
[0008] 其中，所述洗脱液为碳酸氢铵缓冲液、硼酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液中 的任意一种。洗脱液的浓度为0. 05-0. 3mol/L;优选的，所述洗脱液的浓度为0. 1-0. 15mol/ L〇
[0009] 步骤（2)中所述洗涤过程分为两步，即先用洗涤液A进行洗涤，然后再用洗涤液B 进行洗涤；所述洗涤液A包括：缓冲液和无机盐；其中，所述缓冲液为磷酸缓冲液、乙酸缓冲 液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种；所述无机盐为氯化钠；优选的，所述缓冲 液的浓度为〇? 01-0. 2mol/L，优选为0? 01-0. 05mol/L，最优选为20mmol/L;所述无机盐的浓 度为0? 01-0. 2mol/L，优选为0? 01-0. 12mol/L，最优选为0?lmol/L。具体的，所述洗涤液A 包括：20mmol/L梓檬酸+0?lmol/LNaCl;或者，所述洗涤液A包括：20mmol/L乙酸+0?lmol/LNaCl〇
[0010] 步骤（2)中所述洗涤还包括：用洗涤液A洗涤后，再接着用洗涤液B洗涤阳离子层 析柱；所述洗涤液B为盐酸；优选的，所述洗涤液B为l-5mmol/L盐酸；最优选为5mmol/L盐 酸。
[0011] 本发明所述洗涤液A或洗涤液B的pH值为2. 0-4. 5,优选为3. 0-4. 0,更优选为 3. 5-4. 0,最优选为4.0。
[0012] 步骤（1)或步骤（2)中所述的平衡液包括：缓冲液和无机盐；其中，所述缓冲液 为磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或琥珀酸缓冲液中的任意一种或多种；所述无机 盐为氯化钠；优选的，所述缓冲液的浓度为〇? 01-0. 2mol/L，优选为0? 01-0. 05mol/L，最优 选为20mmol/L;所述无机盐的浓度为0? 01-0. 12mol/L，优选为0? 01-0.lmol/L，最优选为 0.01m〇l/L。具体的，所述平衡液包括：20mmol/L柠檬酸+0.01mol/LNaCl;或者，所述平衡 液包括：20mmol/L乙酸+0. 01mol/LNaCl。进一步优选的，所述平衡液pH值为2. 0-4. 5,优 选为3. 0-4. 0,更优选为3. 5-4. 0,最优选为4. 0。
[0013] 本发明所述重组人胰岛素前体的纯化和酶切转换方法中，所述胰蛋白酶的加入量 为：按照质量比计，胰蛋白酶：重组人胰岛素前体=1:100~1:400 ;优选为1:200 ;所述酶 切的温度为20-40°C;酶切的时间为0. 5-3小时；优选的，所述酶切的温度为25-30°C;酶切 的时间为1-1. 5小时；最优选的，所述酶切的温度为30°C;酶切的时间为1. 5小时。
[0014] 本发明所述的分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清为编码重组人胰岛素前 体的基因在真核细胞中进行分泌表达获得的发酵上清；优选的，所述的分泌表达的重组人 胰岛素前体的发酵上清为编码重组人胰岛素前体的基因在毕赤酵母（Pichiapastoris)细 胞中进行分泌表达获得的发酵上清。所述重组人胰岛素前体的氨基酸序列为SEQIDNO. 1 所示（参考《重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究》，刘海峰，华东理 工大学，博士学位论文（2013))。此氨基酸序列包括间隔肽、缺30位的胰岛素B链、小C肽和 胰岛素A链四个部分，三个胰蛋白酶酶切位点：Sitel为间隔肽与B链之间，Site2和Site3 分别为小C肽两端。其中间隔肽及小C肽的长短可以调节，酶切位点可以设计成其他酶的 酶切位点，A、B链可以是在此基础上进行其他修饰，因此认为，以上提及的可修饰或微小变 化的序列改变都在本发明的保护范围内。
[0015] 本发明中根据高效液相检测结果显示，目的蛋白重组人胰岛素前体在发酵上清中 纯度约14% (发酵液液相检测结果显示有两个较大的色素吸收峰，去除色素峰后纯度在 70-80%，特此说明。但本发明中样品均以高效液相检测结果中未去除色素峰的纯度进行统 计。），由于发酵上清中盐浓度较高，需要稀释后才能在上样过程中使目的蛋白吸附在离子 层析介质上。重组人胰岛素前体的生产方法在本领域内是已知的，例如，可以参考中国专利 CN1873006A中公开的方法。
[0016] 本发明将分泌表达的重组人胰岛素前体的发酵上清进行预处理后再上平衡后 的阳离子离子层析柱；其中，所述预处理包括：将发酵上清稀释，加入缓冲剂，使发酵上清 与平衡液具有相同的缓冲盐浓度和pH值；其中，所述缓冲剂为磷酸、乙酸、柠檬酸或琥珀 酸中的任意一种；所述缓冲盐浓度为〇? 01-0. 2mol/L，优选为0? 01-0. 05mol/L，最优选为 20mmol/L;所述pH值为2. 0-4. 5,优选为3. 0-4. 0,更优选为3. 5-4. 0,最优选为4. 0 ;所述稀 释为稀释5-20倍，优选为稀释10倍；用去离子水或注射用水进行稀释。
[0017] 本发明用盐酸或氢氧化钠中的任意一种调节平衡液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液 或发酵上清的pH值。
[0018] 本发明方法中，离子层析采用AKTAexplorer100层析工作站，所用层析柱为 XK26/200 (装填体积为50ml)。所述阳离子层析的离子交换填料为SS印haroseFF、SP SepharoseFF、CMSepharoseFF，Source15S或Source30S中的任意一种；优选为CM S印haroseFF;所述阳离子层析柱的温度为20-25°C;所述洗涤液或洗脱液的线性流速为 7. 5-30mm/min，优选为22. 6mm/min，线性流速是体积流速与纯化柱横截面积的比值；检测 波长为280nm〇
[0019] 本发明涉及的是分泌蛋白的离子层析纯化方法，是利用重组人胰岛素前体与杂质 在特定的缓冲环境下所带有电荷数差异来进行纯化的，且纯化后获得的溶液可以直接进行 酶切。该方法通过低于目的蛋白pi的溶液进行上样，平衡，洗涤，使用高于目的蛋白pi的 溶液进行洗脱，收集的洗脱溶液为适合酶切的碱性缓冲环境，与后续的酶切步骤相结合，大 大简化了纯化步骤，提高了纯度得率。
[0020] 本发明方法经离子层析洗脱后目的蛋白纯度达96%以上，样品收率为96%以上， 胰岛素前体酶切后酶切转化率达95%以上。而按照现有技术的制备方法，均需要在酸性高 盐条件下将胰岛素前体蛋白洗脱下来，然后将洗脱收集液通过沉淀或超滤的方法调整至合 适的缓冲环境、pH值和合适的盐浓度后才能进行酶切，纯化后重组人胰岛素前体纯度达到 92%，样品收率为86-91 %，酶切转化率约60-85%;常规方法不仅操作复杂、繁琐，而且随工 艺步骤的增多导致重组人胰岛素前体纯度不高、收率低，酶切转化率明显降低。
[0021] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0022] (1)本发明中重组人胰岛素前体酵母菌的发酵上清为酸性，pH值3. 5左右，通过稀 释并用少量缓冲盐调节后直接上样，采用阳离子介质纯化，用洗涤液A洗涤大部分杂质，洗 涤液B主要用于减弱柱体中洗涤液A形成的酸性缓冲环境，能使洗脱液更快速的进行目的 蛋白的洗脱，缩短洗脱时间，减少目的蛋白沉淀，同时减少洗脱样品的体积。
[0023] (2)洗脱收集液pH范围为7.8-S.5,盐浓度较低，可直接进行酶切（胰蛋白酶最适 pH范围为7. 8-8. 5)，减少了工艺步骤。经一步离子层析即完成了对发酵液上清的粗纯化和 换相操作，很好的衔接了后续的酶切步骤，简化工艺步骤的同时，提高样品收率。
[0024] (3)本发明中粗样样品的上样量范围为40_60g/L床层体