一株产角蛋白酶的副短短芽孢杆菌及其应用

文档序号:9391816阅读:360来源:国知局
一株产角蛋白酶的副短短芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域,具体涉及一株产角蛋白酶的副短短芽孢杆菌及其粗酶性质。
【背景技术】
[0002]角蛋白酶是一种能专一降解天然角蛋白的蛋白水解酶。角蛋白存在大量的二硫键、氢键和疏水作用,不容易被普通蛋白酶水解,因而大部分未被利用,有的甚至造成环境污染。
[0003]角蛋白酶可用于制革工业。目前制革工业中脱毛基本采用灰碱法,但是脱毛废液中含有高浓度的硫化物,严重污染环境,而用酶法代替灰碱法脱毛便可彻底消除硫化物的污染,酶法具有清洁性、环境友好等特征,同时相比化学制革工艺更能提高产品的质量,因此在制革中应用已越来越广泛
角蛋白酶可用于医药行业。我国每年产生大量的家禽羽毛和废次羊毛,其主要成分是角蛋白。角蛋白酶可将家禽羽毛、废次羊毛降解转变为可溶蛋白质、多肽或者氨基酸,用作医药原料、动物饲料等,变废为宝,减少环境污染。
[0004]目前已发现30多种微生物能分泌角蛋白酶,国内外角蛋白酶的研究主要集中在真菌中的皮肤癣菌和白假丝酵母(Candida a处icaas),放线菌中的链霉菌(Streptomyces)和高温单胞菌属(Therinonspora)及细菌中的地衣芽孢杆菌iBaciIIus licheniformis)和枯草芽抱杆菌subtilis~)等。
[0005]本发明的目的在于提供一株产角蛋白酶的副短短芽孢杆菌,并初步研究了其使用方法。

【发明内容】

[0006](I)平板初筛:从江苏无锡农村羊圈采集土壤样品,取I g 土样添加到10 mL生理盐水中,制备土壤悬液,稀释涂布至初筛培养基平皿中,30°C培养3 do在分离平板上挑取能生长的较大的单菌落,划线分离至纯单菌落。
[0007](2)摇瓶复筛:初筛得到的菌株经摇瓶发酵,测定其上清液角蛋白酶活力,发现7号菌酶活力较高。
[0008](3)菌株16S rDNA鉴定:提取总DNA,用细菌16S rDNA通用引物扩增,得到的基因序列,经测序比对,为副短短芽孢杆菌{Brevibacillus parabrevis),命名为R_7,于2015年5月11日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC N0.10798。
[0009](4)菌株发酵条件初步优化:利用单因素及正交实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化,得到最适培养基配方为羊毛1%,可溶性淀粉1%,玉米粉1%,NaCl 0.15%,NH4Cl 0.05%, K2HPO4 0.03%, KH2PO4 0.04%, MgCl2.6Η20 0.01%。摇床培养条件为:初始 pH 值为8.0,接种量2%,培养温度400C,转速220 r/min,装液量30 mL/250 mL,发酵周期16 h,产角蛋白酶活力达到412 U/mL。
[0010](5)酶学性质研究:分别研究了作用温度和作用PH对该酶活力的影响,发现该角蛋白酶的最适作用温度为40°C,最适pH为7.0。
[0011]其中步骤(I)中所述的初筛培养基为:羊毛粉0.5%,K2HPO4 0.1%,NaCl 0.05%,琼脂粉2% ;步骤(2)中所述的复筛摇瓶发酵培养基为=MgCl2.6H20 0.01%,K2HPO4 0.03%,KH2PO4 0.04%,NaCl 0.05%,NH4Cl 0.05%,羊毛 1%。
[0012]
【附图说明】
[0013]图1为温度对酶活力的影响图2为pH对酶活力的影响
【具体实施方式】
[0014]实施例1角蛋白酶产生菌株的筛选与鉴定
(I)培养基配方
①初筛培养基:羊毛粉0.5%,K2HPO4 0.1%,NaCl 0.05%,琼脂粉2%。
[0015]②种子液体培养基
高氏培养基:可溶性淀粉 2%,KNO3 0.1%, NaCl 0.05%, K2HPO4 0.05%, MgSO4 7H20 0.05%,FeSO4.7 H2O 0.001%。
[0016]LB培养基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,氯化钠1%。
[0017]察氏培养基:蔗糖3%,NaNO3 0.3%,K2HPO4 0.1%,MgSO4 7H20 0.05%,KCl 0.05%,FeSO4 7 H2O 0.001%。
[0018]③初始发酵培养基:MgCl2.6H20 0.01%, K2HPO4 0.03%, KH2PO4 0.04%, NaCl 0.05%,NH4Cl 0.05%,羊毛 1%。
[0019](2)平板初筛及角蛋白活力测定
从无锡农村羊圈采集土壤样品,取I g 土样添加到10 mL生理盐水及玻璃珠的50 mL三角瓶中,摇床振荡15 min待土样分散后,静置5 min,吸取I mL 土壤悬液至9 mL稀释液(无菌生理盐水),得到10 2稀释度悬液,依次按10倍稀释法稀释至10 ?,由此制得各稀释度土壤悬液。分别吸取各稀释度悬液0.1 mL至初筛培养基平板(放置过夜,无杂菌生长),于30°C恒温培养3 d,用接种环逐个挑取生长较大的形态各异的菌落至新的初筛培养基平板,反复划线分离至单菌落。
[0020]经初步分离纯化,得到32株菌,其中13株为放线菌,18株为细菌,I株为真菌,选择生长较良好的菌株继续培养,最终得到18株菌。
[0021](3)摇瓶复筛
将初筛得到的18株菌株,分别采用高氏培养基、LB培养基和察氏培养基进行培养活化制备种子液,按2%的接种量接种至发酵培养基,300C,220 r/min培养64 h,测定发酵上清液角蛋白酶的活力,发现7号菌酶活力较高。
[0022](4)菌株形态
将该菌株在LB固体培养基上用涂布法进行接种培养,37°C条件下培养过夜,发现菌落呈白色、正圆形,表面光滑。革兰氏染色为阳性。电镜下观察为短杆状,有芽孢。
[0023](5) 16S rDNA 鉴定
提取总DNA,用细菌16S rDNA通用引物扩增,得到基因序列,经测序比对,与副短短芽孢杆菌的16S rDNA序列同源性高达99%,初步判断其为副短短芽孢杆菌{Brevibacillusparabrevis),命名为 R-7。
[0024]
实施例2菌株发酵条件初步优化
利用单因素及正交实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化,得到最适培养基配方为羊毛 1%,可溶性淀粉 1%,玉米粉 1%,NaCl 0.15%,NH4Cl 0.05%,K2HPO4 0.03%,KH2PO40.04%,MgCl2.6H20 0.01%。摇床培养条件为:初始pH值为8.0,接种量2%,培养温度40 °C,转速220 r/min,装液量30 mL/250 mL,发酵周期16 h,产角蛋白酶活力达到412 U/mL。
[0025]
实施例3酶学性质研究
初步研究了所产角蛋白酶的粗酶酶学性质,分别研究了作用温度(30°C _70°C)和作用pH (6.0-10.0)对该酶活力的影响,研究结果发现,该角蛋白酶的最适作用温度为40°C (图
1),最适pH为7.0 (图2)。
【主权项】
1.一株角蛋白酶产生菌株副短短芽孢杆菌、Brevibacillus paraAreKis),命名为副短短芽孢杆菌R-7,现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC N0.10798,保藏日期为2015年5月11日。2.保藏编号为CGMCCN0.10798的菌株的培养方法,其培养基为:羊毛1%,可溶性淀粉1%,玉米粉 1%,NaCl 0.15%,NH4Cl 0.05%,K2HPO4 0.03%,KH2PO4 0.04%,MgCl2.6H20 0.01% ;培养条件为:初始PH值为8.0,接种量2%,培养温度40°C,转速220 r/min,装液量30 mL/250mL,发酵周期16 h,产角蛋白酶活力达到412 U/mL。3.保藏编号为CGMCCN0.10798的菌株所产的角蛋白酶液的最适作用温度为40°C,最适pH为7.00
【专利摘要】本发明公开一株角蛋白产生菌株及其培养条件和酶学性质,属于微生物技术领域。经鉴定,该菌株为副短短芽孢杆菌(<i>Brevibacillus?parabrevis</i>),命名为副短短芽孢杆菌R-7,现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC?No.10798。经初步优化,该菌株的培养基为:羊毛1%,可溶性淀粉1%,玉米粉1%,NaCl?0.15%,NH4Cl?0.05%,K2HPO4?0.03%,KH2PO4?0.04%,MgCl2·6H2O?0.01%。摇床培养条件为:初始pH值为8.0,接种量2%,培养温度40℃,转速220r/min,装液量30mL/250mL,发酵周期16h,产角蛋白酶活力达到412U/mL。该角蛋白酶最适作用温度为40℃,最适pH为7.0。该酶在制革及医药等领域具有重要应用。
【IPC分类】C12R1/01, C12N9/48, C12N1/20
【公开号】CN105112344
【申请号】CN201510639836
【发明人】龚劲松, 侯璎朔, 罗阳, 翟靖鑫, 张楠, 朱佳能, 史劲松, 许正宏, 李恒
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年10月8日
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