一种鞘脂菌(Sphingobium sp.)IBY及其在吸附降解疏水性有机物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY及其在 吸附降解疏水性有机物中的应用。
【背景技术】
[0002] 细菌细胞的疏水相互作用是指疏水性较强的细胞能够避开水而易与疏水性较强 的物质发生作用。疏水性是决定细菌非特异性黏附到各种生物和非生物表面及界面的最重 要因素之一，也是影响细菌吸收和降解疏水性有机物的主要因素之一。在利用微生物降解 疏水性有机物的过程中，细胞表面疏水性影响细菌对污染物的黏附，能促进细菌对疏水性 有机物的吸附和降解。
[0003] 结构决定性质，细菌细胞表面疏水性是菌体的表面性质之一，也必定是菌体表面 结构所决定的。研究表明，革兰氏阴性菌的脂多糖和外膜蛋白与菌体表面疏水性具有一定 的关联。鞘脂菌（Sphingobium)属细菌属于广义上的鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas)，其细 胞膜组成不同于一般的革兰氏阴性菌特有的脂多糖，而取而代之的是鞘糖脂，因此推测广 义鞘氨醇单胞菌比其他革兰氏阴性菌具有更强的细胞表面疏水性。
[0004] 虽然广义鞘氨醇单胞菌被认为比其他革兰氏阴性菌具有更强的细胞表面疏水性， 但目前所报道的广义鞘氨醇单胞菌都是亲水菌，它们细胞表面疏水性都不高，仍不属于疏 水细菌，而且细胞表面疏水性随着细菌生长状态的不同而表现差异，并与培养过程添加的 碳源物质和电子受体有关。一种性质稳定的真正意义上的疏水细菌的获得，无疑将给疏水 性有机物的污染问题的解决带来曙光。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种疏水鞘脂菌（Sphingobiumsp. )IBY，该细菌于 2015年7月1日保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保 藏编号为CCTCCNO:M2015419。
[0006] 本发明的鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY是通过对广东汕头某电子垃圾集中处理 区的河床底泥进行富集培养、分离、纯化，得到Sphingobium属的一个新种。
[0007] 鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的形态学和生理生化特征：该菌24h平板培养物菌 落圆形、黄色，突出培养基，透明，直径0. 5-1. 0mm。菌体革兰氏阴性，不形成芽孢，端生鞭毛。 菌体呈现长1. 0-3. 0ym宽0. 6-0. 9ym的长杆状形态。氧化酶和过氧化氢酶阳性。该菌能 在好氧和兼性厌氧条件下生长，生长pH4. 0~9. 0。
[0008] 鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的分子分类学地位：按照常规方法提取鞘脂菌 (Sphingobiumsp.)IBY的总DNA。采用16SrRNA通用引物8F和1492R利用高保真酶扩增其 16SrRNA基因，将PCR产物连接T载体后挑选阳性克隆进行测序，获得其16SrRNA基因序 列，其序列如SEQIDNO. 1所示。将该序列与NCBI的GenBank中序列进行比对，进行BLAST 分析，结果发现鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的16SrRNA基因序列与Sphingobium属的 已有模式菌株具有较高的相似性，其中与SphingobiumxenophagumBN6的序列相似性为 99 %。再扩增其gyrB基因，将PCR产物连接T载体后挑选阳性克隆进行测序，获得的gyrB基 因序列，其序列如SEQIDNO. 2所示。经BLAST分析，其与SphingobiumxenophagumBN6相 似度为96 %。采用复性速率液相杂交法测得鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY与Sphingobium xenophagumBN6的全基因组DNA-DNA杂交率为54. 5%。
[0009] 鞘脂菌（Sphingobiumsp. )IBY的细胞表面疏水性：通过微生物黏着碳氢化合物 (MATH)法测得该菌的细胞表面疏水性为58. 9%;水相接触角测量（CAM)法测得该菌的水相 接触角为60. 4°。上述两种结果均远远大于同属亲缘性最高的Sphingobiumxenophagum BN6,并且属于疏水细菌范畴。
[0010] 综合上述形态学、生理生化特征和分子分类学结果，认为（Sphingobiumsp.)IBY 属于Sphingobium属的一个新种，于2015年7月1日保存于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2015419。
[0011] 本发明的第二个目的是提供鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY在吸附降解疏水性有 机物中的应用，优选为在吸附降解多溴联苯醚或苯系物中的应用，更优选的为在吸附降解 十溴二苯醚中的应用。
[0012] 本发明的鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY具有很强的细胞表面疏水性，在纯有机溶 剂十六烷烃中能较长时间保持较高存活率，能有效地吸附十溴二苯醚、苯系多种疏水性有 机物，在疏水有机物（比如十溴二苯醚）为碳源的培养基中能较快降解多种疏水性有机污 染物。
[0013] 本发明提供了 一种具有降解疏水性有机物能力的疏水细菌新种一一鞘脂菌 (Sphingobiumsp.)IBY，为疏水性有机污染物的环境污染治理提供了有效的降解菌种资 源。
[0014] 本发明的Sphingobiumsp.IBY已于2015年7月1日保藏于中国典型培养物保藏 中心（CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2015419。
【附图说明】
[0015] 图1是鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY在水相/十六烷烃两相系统中分离不同时 间的照片。图中分别表示SphingobiumxenophagumBN6(B)和鞘脂菌（Sphingobiumsp.) IBY(Cl)在水相/十六烷烃两相系统中20min和18h的存活情况。
[0016] 图2是鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的水相接触角照片。其中，B为Sphingobium xenophagumBN6的水相接触角，Cl为鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的水相接触角。
【具体实施方式】
[0017] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018] 实施例1 :鞘脂菌（Sphingobiumsp.)IBY的分离和鉴定
[0019] 取20g广东汕头某电子垃圾集中处理区的河床底泥，加入80mL无菌水搅匀打散 后，过筛去掉植物残渣及大颗粒物；滤液再经过2000Xg，常温，离心2min，去掉小颗粒物； 得到的上清液经过6000Xg，常温，离心lOmin，收集沉淀物；沉淀物加入80mL无菌水，洗 涤、离心处理三次。最后获得的沉淀物作为种源，接种到无机盐培养基中（Na2HP045. 7mM，KH2P043. 3mM，NH4C1 18.OmM，酵母抽提物0? 2g/L，0 _环糊精10mM)，培养基中同时加入1yM 的BDE209和2.8g/L的零价铁粉。固体培养基中加入20g/L琼脂。培养物置于30°C静置避 光培养，每月经过6000Xg，常温，离心lOmin，收集沉淀物，重新转入新的培养基进行培养。 连续培养12个月以后，将富集培养物在固体培养基上划线培养，得到单菌落。由此获得菌 株IBY。
[0020] 将菌株IBY进行形态学和生理生化鉴定，其形态学和生理生化特征如下：该菌24h 平板培养物菌落圆形、黄色，突出培养基，透明，直径〇. 5-1.Omm。菌体革兰氏阴性，不形成芽 孢，端生鞭毛。菌体呈现长1. 0-3. 0ym宽0. 6-0. 9ym的长杆状形态。氧化酶和过氧化氢 酶阳性。该菌能在好氧和兼性厌氧条件下生长，生长pH4. 0~9. 0。
[0021] 按照常规方法提取菌株IBY的基因组总DNA。采用16SrRNA基因通用引物8F 和 1492R扩增其 16SrRNA基因，8F:5' -AGAGTITGATCMTGGCTCAG-3'，M=A/C;1492R: 5'-GGTACCTTGTTACGACTT-3'。选择如下PCR反应体系和程序：10XPCRbuffer5. 0yL， 10.Ommol/LdNTP1. 0yL，10.Opmol/uL8F引物 1. 0yL，10.Opmol/uL1492R引物 1. 0yL， lOng/uL基因组DNA1. 0yL，2. 5U/yL高保真Taq酶 0? 5yL，去离子水补足 50. 0yL。94°C 预变性5min后，94°C变性45s、56 °C退火45s、68 °C延伸1. 5min，30个反应循环后，68 °C延伸 lOmin;扩增其16SrRNA基因。将PCR产物连接T载体后挑选阳性克隆进行测序，获得的 16SrRNA基因序列，其序列如SEQIDNO. 1所示。将该序列与NCBI的GenBank中序列进行 比对，进行BLAST分析，结果发现菌株IBY的16SrRNA基因序列与Sphingobium属的已有 模式菌株具有较高的相似性，其中与SphingobiumxenophagumBN6的序列相似性为99%。
[0022] 采用引物gyrB-U:5' -ATGAGCGASGAAMCCCAGAA-3'，S=C/G，M=A/C以及引 物gyrB-D:5' -GTCCAGATTGGCGACGTTC-3'，并选择如下PCR反应体系和程序：10XPCR buffer5. 0yL，10. 0mmol/LdNTP1. 0yL，10. 0pmol/uLgyrB-U引物 1. 0yL，10. 0pmol/uL gyrB-D引物 1. 0yL，lOng/uL基因组DNA1. 0yL，2. 5U/yL高保真Taq酶 0? 5yL，去离子水 补足50. 0yL。94°C预变性5min后，94°C变性45s、53°C退火45s、68°C延伸3min，30个反应 循环后，68°C延伸lOmin;扩增其gyrB基因。将PCR产物连接T载体后挑选阳性克隆进行测 序，获得的gyrB基因序列，其序列如SEQIDN0. 2所示。经BLAST分析，其与Sphingobium xenophagumBN6 相似度为 96%。
[0023] 按照常规方法提取菌株IBY和BN6的基因组总DNA，测定DNA在A23Q、A26。和A28。波 长的吸光值，若比值符合A23。：A26。：A2SQ= 1 : 0.450 : 0.515的比例关系，则进行后续操 作，否则继续纯化DNA。将符合要求的DNA置于冰浴中40W超声4次，每次15s。超声剪切后 的DNA样品用0. 1XSSC缓冲液配制成0D26。为1. 5~2. 0的DNA样品。分别取IBY、BN6的 DNA样品各500yL于两个比色皿中，IBY、BN6各250yL混合装于第三个比色皿中，置于相 应样品槽中。99°C变性lOmin，并用预热的吸管吸取预热的10XSSC缓冲液500yL加入变 性样品中，混勾，在最适复性温度71 °C复性30min，记录吸光值0D26。，每隔5min记录一次。采 用以下公式求得样品IBY、BN6和混合样品的复性速率VIBY