小鼠脐带间充质干细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种小鼠脐带间充质干细胞的分离培养方法，属于细胞的体外培养领域。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一类起源于胚胎的多潜能成体干细胞，目前已成功从多种组织中分离获得，常见的如骨髓、脐带、胎盘、脂肪等。间充质干细胞的突出优势在于:高度的自我更新能力、强大的多向分化潜能和宽广的免疫调控功能，因而成为“干细胞疗法”中的首选细胞源。
[0003]间充质干细胞于临床应用的关键是探寻其理想的组织来源。间充质干细胞最早在骨髓中发现，但骨髓来源的间充质干细胞存在供体年龄、组织取材和免疫排斥的限制。脐带属于胚胎外组织，内含更原始的间充质干细胞，免疫原性更低，不但具有与胚胎干细胞极为相似的基因表达谱(Hsieh JY, Fu YS, Chang SJ, et al.Funct1nal module analysisreveals differential osteogenic and sternness potentials in human mesenchymalstem cells from bone marrow and Wharton’s jelly of umbilical cord.Stem cellsand development.2010，19:1895-910.)，且较其他组织来源的间充质干细胞具备更高的增殖潜能、更强的扩增能力以及更短的群体倍增时间(Li Wffj Wei YHj Li H，et al.1solat1n and characterizat1n of a novel strain of mesenchymal stem cells frommouse umbilical cord: potential applicat1n in cell-based therapy.PloS one.2013,8:e74478.)。因此，脐带来源的间充质干细胞很好地弥补了骨髓来源的缺点，更不受伦理道德的约束，可作为理想的细胞源。
[0004]在临床前的研究中，人脐带来源的间充质干细胞已经应用于某些啮齿动物模型中，如中风(Zhu Jj Liu Qj Jiang Y，et al.Enhanced ang1genesis promoted byhuman umbilical mesenchymal stem cell transplantat1n in stroked mouse isNotchl signaling associated.Neuroscience.2015，290C:288-99.)、肝损伤(BurraPj Arcidiacono D， Bizzaro D， et al.Systemic administrat1n of a novel humanumbilical cord mesenchymal stem cells populat1n accelerates the resolut1nof acute liver injury.BMC gastroenterology.2012，12:88.)、肾损伤(Li Wj ZhangQj Wang Mj et al.Macrophages are involved in the protective role of humanumbilical cord-derived stromal cells in renal ischemia—reperfus1n injury.Stem cell research.2013，10:405-16.)等。然而，有研究指出，人和小鼠来源的间充质干细胞除共性外，确实存在生物学和功能学特性上的差异(Bernardo ME, Fibbe WE.Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammat1n.Cell stemcell.2013，13:392-402.)，如果将人脐带间充质干细胞异种移植入啮齿动物体内，有可能会改变宿主免疫应答，带来结果的复杂性。动物模型构建是为临床研究服务，模型设计理应尽可能地模拟临床实践。那么，小鼠模型中同种异体细胞移植的设计将更为合理。
[0005]目前，小鼠的间充质干细胞主要来源于小鼠骨髓(Shiratsuki S，Terai S，Murata Y, et al.Enhanced survival of mice infused with bone marrow-derived ascompared to adipose-derived mesenchymal stem cells.Hepatology research: theofficial journal of the Japan Society of Hepatology.2015.)，其次为小鼠月旨肪(LiQ, Zhou XM, Shi YQ, et al.1n Vivo Tracking and Comparison of the TherapeuticEffects of MSCs and HSCs for Liver Injury.PloS one.2013, 8.)，而小鼠脐带全球仅报道I例。该研究用的分离方法为经典的组织贴壁法，程序比较多，细胞培养基中更额外添加了诸多商品化因子，如地塞米松、表皮生长因子、血小板来源生长因子、白血病抑制因子等。因此，鉴于小鼠脐带间充质干细胞培养可能成为阐明许多疾病分子机制的重要平台，一种新的、简单易行的且节约成本的分离培养方法的建立是非常必要而有意义的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种小鼠脐带间质干细胞新的分尚培养方法。
[0007]—种培养小鼠脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤:
(1)将孕龄达15-19天的孕鼠断颈处死，放入消毒酒精中浸泡5分钟，于超净工作台中取出，腹部朝上置于无菌1cm大皿中；
(2)用无菌眼科剪和镊子将孕鼠腹部表皮和粘膜层逐层剪开，取出串珠样受孕子宫，放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的PBS中浸泡5_10分钟；
(3)用无菌眼科镊子将每只胎鼠剥离出来，剔净羊膜层，再配合眼科剪分离出连接胎鼠肚脐与胎盘的脐带组织，放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的PBS中洗涤并浸泡5-10分钟；
(4)将脐带组织浸于含双抗的培养基中，用眼科剪和镊子将其逐根剪碎；
(5)将脐带组织块(连同培养基)均匀铺在细胞培养皿(3.5cm小皿)中，置于37°C细胞培养箱中培养；
(6)脐带组织块培养24h到48h后即有细胞爬出，第3天换正常培养基，以后每3天换一次液，当PO代细胞生长融合达80-90%时，用0.25%的胰酶消化传代培养，持续传代直至细胞呈现均一形态，做下一步的鉴定。
[0008]其中，步骤(I)中孕鼠的孕龄以15-19天为宜，孕龄太小，胎鼠尚未成熟，其脐带又软又嫩，分离较难；
步骤(2)和(3)中由小鼠体内分离出来的子宫和脐带组织宜放入含高强度抗生素PBS中浸泡和洗涤:青霉素和链霉素可应用的浓度均为500U-1000U，时间为5-10分钟；
步骤(4)中“含双抗培养基”的成分及其含量为:F12/DMEM 86%_84% (V/V)、FBS 14-16%(V/V)、90-110U青霉素和90-11U链霉素，该浓度的双抗不仅有效抑菌，而且对细胞没有任何副作用；
步骤(4)中将脐带组织剪碎至0.5-1.0_3，组织块越小，贴壁后其细胞爬出的效率越尚;
步骤(5)中将细小组织块悬液均匀铺在小皿中，培养基少量为宜。培养基量多，细小组织块悬浮不易贴壁，大大降低原代细胞得率； 步骤(5)中将原代小皿平稳轻轻地放入37°C、5%0)2饱和湿度培养箱，平放，不宜用力推拉，影响组织块贴壁；
步骤(6)中脐带组织块爬出细胞的效率较高，快则24h，慢则48h即有细胞爬出，培养第3天换的正常培养基不含双抗，成分为F12/DMEM 86-84% (V/V)，FBS 14-16% (V/V)；
步骤(6)中爬出的PO代细胞形态呈现不均一性，当生长融合达80-90%时予以消化，消化下来的细胞宜以4-2:1的高密度比例传P2代，此后可按1:1-2比例传代，直至细胞呈现均一后可按常规比例传代培养。
[0009]步骤(6)中PO代细胞消化时，因脐带组织块过小，消化前机械性剔除很可能带来大量细胞层的丢失，故组织块宜在重悬时被尽可能多地剔除，采取“重量挂壁法”。