一种治疗视网膜变性的干细胞制剂及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及再生医学和干细胞生物技术领域，涉及一种治疗视网膜变性的干细胞制剂及其使用方法。
【背景技术】
[0002]人的视网膜约厚0.1?0.5毫米，在组织学上将其分为10层，其中主要有4层细胞组成，由外向内依次是色素上皮细胞层、视细胞层、双极细胞层及神经节细胞层。视网膜色素上皮层与脉络膜紧密相连，由色素上皮细胞(retinal pigment epitheium，RPE)组成，正常的RPE是具有极性的单层细胞，位于视网膜的最外层。它是代谢高度活跃的细胞层，具有支持和营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用。其主要功能包括转运营养物质，视黄醇回收利用，产生色素以及吞噬视锥、视杆细胞外节。
[0003]视网膜变性疾病，包括年龄相关性黄斑变性，视网膜色素变性等，发病率逐渐升高，是主要的致盲性疾病。这些疾病都是以进行性色素上皮细胞、光感受器细胞的功能丧失，凋亡或坏死为特点，造成视力不可逆的损害。
[0004]视网膜变性主要表现为Bruch’s膜增厚、RPE色素沉着过度和RPE细胞损耗等。临床上主要分为萎缩型(干性)和新生血管型(湿性或渗出型)两种类型，前者主要有玻璃膜疣、RPE异常和地图样萎缩改变；后者主要以脉络膜新生血管(choroidalneovascularizat1n, CNV)、RPE脱离或盘状纤维化为病理特点。
[0005]目前对于视网膜变性，特别是黄斑变性，现代医学没有特效的治疗方法。临床常根据病程的阶段，使用抗氧化剂，维生素类，止血剂，以及视神经营养药或细胞激活制剂，玻璃体内注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelialgrow factor，VEGF)等治疗方式，但仅能延缓疾病的进展，不能从根本上替换掉病变的视网膜细胞，逆转病程。过去尝试用手术的方式替换黄斑部的RPE，主要有黄斑转位手术和RPE自体移植术，在长期的随访中证实可维持或提高患者的视力。此类手术为移植健康的RPE治疗视网膜变性疾病提供了依据，然而上述手术存在创伤大、操作复杂，并发症多的缺点，另外，对于光感受器严重受损的病例则难以发挥作用。因此寻找一种操作简单，便于推广、创伤性小的细胞替代方法越来越受到重视。
[0006]干细胞是一群具有自我更新及多向潜能的细胞群。利用干细胞的可塑性，定向分化为目的细胞进行细胞移植或利用干细胞的分泌细胞因子修复受损的视网膜及RPE，已经成为视网膜变性疾病治疗的研究热点。
[0007]干细胞移植治疗视网膜变性疾病的机制:①细胞替代，由健康的干细胞替代丢失的病变细胞；②营养支持，移植的健康干细胞促进周围细胞的存活；③移植区微环境的免疫调控作用，如促进移植区原态细胞的逆分化。理论上，建立有效的新的突触联系和在此基础上的视功能改善，是干细胞移植成功的标准。研究表明，只有将干细胞诱导至发育状态并接近成熟，才能发挥移植功效。理想的供体细胞应当具有一定的可塑性，即处于感光前体细胞向成熟细胞发育的关键期。
[0008]为将各种来源干细胞精确诱导至感光前体细胞，必须了解人胚胎感光前体细胞的发育。人胚胎视网膜发育受严格的程序控制，在胚胎7?8周，神经节细胞即开始出现，随后，视锥细胞、水平细胞、无长突细胞逐渐定向分化；胚胎12周左右，视网膜的大体层次开始形成，而双极细胞、视杆细胞、原态细胞发育稍晚。高度合作的核转录因子精确调控感光细胞的分化，这些基因按照时间、空间顺序启动或关闭，对胚胎细胞的生长和分化进行调节。具有移植功效的感光前体细胞的特征:①处于有丝分裂末期，已经定向分化，不再继续增殖；②表达0tx2、PAX6、CRX、Nrl等核转录因子！③尚未发育为成熟的感光细胞，细胞内逐渐形成各种视蛋白，即具有可塑性。
[0009]骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类多功能干细胞，其来源相对广泛，取材方便安全，不存在伦理方面的限制；具有强大的旁分泌作用，其分泌的神经营养因子和生长因子能促进损伤组织的修复；具有主动向损伤组织区域迀移的作用；移植后无肿瘤形成的倾向；免疫原性低，可进行自体或同种异体移植，发生排斥反应的机率较低。BMSCs同样具有多向分化潜能，除了可分化为中胚层起源的骨细胞、软骨细胞、月旨肪细胞，在一定条件下BMSCs还可以跨胚层分化为神经细胞、心肌细胞、胶质细胞等。基于以上这些特性，使得BMSCs在组织修复和基因治疗方面的临床应用潜能受到越来越多的关注，在移植视网膜变性疾病治疗研究中也备受推崇。
[0010]目前细胞移植途径主要有静脉注射，玻璃体腔注射和视网膜下注射。(I)静脉注射:是将细胞悬液注射到静脉中，细胞通过体循环到达眼部，并迀移至视网膜下或视网膜内。该方法操作简单，便于反复注射，不受注射容积的限制，但是存在诱导血栓形成及过敏的风险，并且存在细胞经过全身循环后能否到达视网膜附近的争议。(2)经玻璃体腔注射:是将细胞悬液注射到玻璃体腔中，通过玻璃体腔迀移到视网膜内。由于内界膜的阻碍，只有不到1%的细胞能到达视网膜内，并且球内易感染。(3)视网膜下注射:直接把细胞注射移植到靶部位即RPE层与感光细胞层之间。尽管受到体积限制，单次注射的细胞数量偏少，但是所注射的细胞都能进入视网膜下，只要有足够的活细胞数量并在局部微环境的状态下能向RPE及视网膜光感受器细胞分化，便有可能发挥细胞替代作用，因此应是最理想的移植方法。
[0011]尽管近年来干细胞移植治疗视网膜变性疾病的研究取得了突飞猛进的进展，但仍然面临着许多障碍。突出的问题是移植细胞在视网膜下间隙的存活率仅约0.01%。因此，提高移植细胞的存活和迀移能力是提高移植效果的关键。目前，将细胞悬液直接注入视网膜下腔的移植方法虽然简便易行，但干细胞同时失去了维系其生存的微环境。随着科技的发展和进步，人们在不断地寻找治疗视网膜变性相关的新的药物和一种操作简单，便于推广、创伤小的细胞替代方法逐渐成为近些年来的关注热点。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是提供一种治疗视网膜变性的干细胞及制剂，通过将骨髓间充质干细胞优化培养和诱导分化，提高了其分化为视网膜神经前体样细胞效率，其移植效果与视网膜前体细胞具有相似的功效，使移植区视网膜功能有效改善，为干细胞移植治疗视网膜变性疾病提供了一种理想的细胞来源，具有很强的优越性。本发明的另一目的在于提供上述干细胞制剂的制备方法，该方法经分离、培养、传代和诱导得到的干细胞产品，制备过程简单、可靠，重现性好。
[0013]本发明的再一目的是提供一种治疗视网膜变性的干细胞制剂的使用方法，是一种操作简单，便于推广、创伤小的细胞替代方法。
[0014]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为:一种治疗视网膜变性的干细胞制剂，是通过以下步骤制备的:
(1)获得肝素化骨髓血；
(2)骨髓血的处理和接种:以体积比1:2加入含体积分数为10%FBS的LG-DMEM培养液，混合均匀后，直接接种于培养瓶中；
(3)原代细胞的培养:将上述培养瓶置于5%C02、37°C培养箱进行培养，48h首次不清洗直接换液，以后每2?3d换液I次，且换液前用缓冲溶液PBS清洗，均为全量换液；细胞长至80%?90%融合后以0.25%胰酶消化收获原代细胞，记为PO代细胞；
(4)P1传代细胞的培养:将上述PO代细胞以5X14个/ml密度接种于培养瓶中，培养基为含体积分数为10%FBS的LG-DMEM培养液，置于5%C02、37°C培养箱进行培养，24h首次不清洗直接换液，以后每2d换液I次，且换液前用缓冲溶液PBS清洗，均为全量换液；细胞长至80%?90%融合后以0.025%胰酶消化收获原代细胞，记为Pl代细胞；
(5)P2?P4传代细胞的培养:将上述Pl代细胞以5X 14个/ml密度接种于培养瓶中，重