黑曲霉果胶裂解酶的突变体及玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及黑曲霉果胶裂解酶的突变体及玉米酒精发酵 生产中糖浆的降粘剂。
【背景技术】
[0002] 市场上的玉米酒糟蛋白饲料产品有两种：一种为DDG(DistillersDried Grains)，是将玉米酒精糟作简单过滤，滤渣干燥，滤清液排放掉，只对滤渣单独干燥而获得 的饲料；另一种为DDGS(DistillersDriedGrainswithSolubles)饲料，即含有可溶固形物 的干酒糟，是将滤清液干燥浓缩后再与滤渣混合干燥而获得的饲料。后者的能量和营养物 质总量均明显高于前者。
[0003]玉米酒精发酵后的蒸馏废醪经离心或板框过滤，得到湿酒糟（WDG)和清液（DGS)。 受粘度和悬浮物的限制，清液目前只能浓缩为干物质含量约29 %的糖浆，再加入湿酒糟 (WDG) -起烘干，制备出DDGS。由于糖浆浓度不高，带入大量的水分，极大增加饲料烘干蒸 汽能耗，抬升烘干温度，延长高温停留时间，营养物质得到大量破坏，产生大量美拉德反应， 使得DDGS颜色较深，极易有焦糊味，影响饲养动物的适口性，最终影响了DDGS饲料的等级 和价格，减少玉米燃料乙醇企业的利润。
[0004] 开发能有效降低糖浆粘度的降粘剂，将有助于减少糖浆蒸发浓缩的时间和能耗， 减少糖浆与湿酒糟烘干时的营养物质损失，有利于DDGS饲料品级和价格的提高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种果胶裂解酶的突变体，具有优异的酶稳定性和催化活 性。
[0006] 本发明的另一目的是提供所述突变体的制备方法，该方法简单，高效。
[0007] 本发明的再一目的是提供玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂，可以在低能耗的条 件下对玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆进行快速、高效降粘。
[0008] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0009] 黑曲霉果胶裂解酶的突变体，是将黑曲霉果胶裂解酶氨基酸序列第241位的赖氨 酸用甲硫氨酸取代后所得。
[0010] 本发明还提供黑曲霉果胶裂解酶的突变体的编码基因及含有所述编码基因的表 达盒、重组载体、重组菌或细胞系。
[0011] 本发明还提供所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体的制备方法，包括下述步骤：通过 发酵携带权利要求1所述突变体编码基因的大肠杆菌得到所述突变体。
[0012] 本发明还提供玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂，是所述黑曲霉果胶裂解酶的突 变体与选自纤维素酶、木聚糖酶、0 _葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶中的 一种或两种以上的混合物。
[0013] 优选的技术方案中吗，所述降粘剂按照重量份含有下述成分：
[0014] 所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体17-20份，
[0015] 纤维素酶40-50份，
[0016] 木聚糖酶8-15份，
[0017] 葡聚糖酶10-12份，
[0018] 甘露聚糖酶7-10份，
[0019] 谷氨酰胺转氨酶0? 6-2份，
[0020] 脂肪酶0.2-2份。
[0021] 在本发明中，所述降粘剂还含有稳定剂，所述稳定剂选自甘油、乙醇、氯化钠中的 一种或两种以上。
[0022] 在本发明中，所述降粘剂还含有防腐剂，所述防腐剂选自山梨醇、松油、麝香草酚、 苯甲酸钠中的一种或两种以上。
[0023] 本发明还提供所述降粘剂在降低玉米酒精发酵生产中糖浆粘度方面的应用。
[0024] 本发明黑曲霉果胶裂解酶的突变体，具有优异的酶稳定性和催化活性。本发明所 述突变体的制备方法，简单、高效。采用本发明降粘剂，可以在低能耗的条件下对玉米酒精 发酵生产中的糖浆进行快速、高效降粘。本发明降粘剂，对糖浆的降粘可实现将清液浓缩到 70%浓度以上，减少了酒精发酵过程中蒸汽的消耗，提高副产品DDGS的一级品率。本发明 为玉米燃料乙醇的节能减排生产、副产品DDGS的提升，提供了一条有效方法。
【附图说明】
[0025] 图1降粘剂1及对照降粘剂1添加量对浓度为29 %糖浆粘度的影响，其中Cx表示 添加的降粘剂与糖衆的质量比，Cp表示粘度（单位mPa?S)。
[0026] 图2降粘剂2及对照降粘剂2添加量对浓度为29 %糖浆粘度的影响，其中Cx表示 添加的降粘剂与糖衆的质量比，Cp表示粘度（单位mPa?S)。
【具体实施方式】
[0027] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0028] 实施例1黑曲霉果胶裂解酶突变体的制备及性质
[0029] 1.突变体的序列
[0030] 黑曲霉（Aspergillusniger)果胶裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNO: 1所示（该 序列由NCBI的黑曲霉果胶裂解酶（GenBank:AIE38009. 1)原始序列中的127位和204位的 X分别取为K与D而得），基因cDNA序列如SEQIDN0:2所示。
[0031] 经过分子模拟软件PROPKAsoftware分析，将黑曲霉果胶裂解酶氨基酸序列第 241位的赖氨酸（K)用甲硫氨酸（M)取代，得到突变体K241M，相应地替换密码子。针对大 肠杆菌，利用http://www.icat.de网站进行密码子优化，最终得到突变体K241M的编码基 因序列，如SEQIDN0:3所示。
[0032] 2.黑曲霉果胶裂解酶突变体的制备
[0033] 委托南京金斯瑞生物科技有限公司（http://www.genscript.com.cn/)合成突变 体K241M的基因片段（SEQIDN0:3)。通过酶切位点NdeI和XhoI，将突变体K241M的基 因片段插入pET-22b表达载体质粒，然后导入大肠杆菌，得到重组菌1。采用IPTG诱导重组 菌1表达突变体K241M。将诱导培养后的重组菌1发酵液离心，分离上清液和沉淀，分别进 行SDS-PAGE电泳，发现仅沉淀泳道出现大小约为42kDa的条带。将沉淀采用PBS缓冲液洗 涤后，采用上清液相同体积的PBS缓冲液悬浮后超声破碎，离心取上清液作为突变体K241M 粗酶液。
[0034] 采用常规方法，针对大肠杆菌，利用http://www.icat.de网站对原始黑曲霉果胶 裂解酶基因cDNA序列（SEQIDN0:2)进行密码子优化，得到序列A。采用上述相同方法，构 建携带序列A的重组菌2。采用IPTG诱导后，超声裂解破碎菌体，取上清液作为原始黑曲霉 果胶裂解酶粗酶液。在制备果胶裂解酶的发酵过程中，发现重组菌1和重组菌2的生长密 度仅有微小差别。
[0035] 3.黑曲霉果胶裂解酶突变体及原始酶在稳定性及催化活性方面的比较
[0036] (1)按照前述方法，诱导表达原始黑曲霉果胶裂解酶、突变体K241M，分别定义为 WT组和K241M组；
[0037] (2)上述两个实验组中，分别取5mL同样密度（0D6。。相同）的重组菌液，超声破碎 制得粗酶液，待用；
[0038] (3)测试各组粗酶液初始酶活力，以及冻融1次、反复冻融3次和反复冻融5次后 酶活力。酶活力测试方法具体如下：用pH9. 5、浓度为0. 05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲 液配制5mg/mL的聚半