一种提取游离dna的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及高通量DNA检测技术领域，具体地，涉及一种提取血浆或尿液中游离 DNA的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 游离DNA(cellfreeDNA,cfDNA)是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是由单链或 双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA-蛋白质复合物或游离DNA两种形式 存在。健康人外周血也存在cfDNA，但肿瘤患者的外周血cfDNA含量与健康人外周血cfDNA 相比较有显著性的增高，且肿瘤患者外周血DNA中存在基因突变、重组、缺失等。肿瘤患者 外周血游离DNA主要为肿瘤细胞的坏死或凋亡、微转移灶或循环肿瘤细胞的裂解和增殖旺 盛的肿瘤细胞所释放。
[0003] 肿瘤基因检测最直接的对象是患者原代组织标本，但对于那些未进行过手术的肿 瘤患者，肿瘤标本不易获取，而活检穿刺的技术虽已较为成熟，但患者接受度相对较低，尤 其对那些已发生多处转移的患者。即便之前留有标本，但往往是几个月前甚至是几年前保 存的局部标本，鉴于肿瘤基因组的动态性与异质性，它们反映的信息已经是过时的或者代 表的信息不全。临床研究表明，CfDNA能良好地反映患者整体的肿瘤负荷、恶性程度、转移能 力以及实时的基因突变信息，与肿瘤组织的基因信息具有较好的一致性。一项多中心研究 发现，非小细胞肺癌（NSCLC)患者血衆中循环游离肿瘤DNA(circulating-freetumorDNA) 的表皮生长因子受体（EGFR)突变和患者肿瘤组织中的DNA的突变直接相关。研究纳入了 1060例EGFR突变阳性且处于不同阶段的患者，分析并对比了患者的肿瘤组织及其配对的 血浆DNA，结果发现652名患者的肿瘤组织和配对血浆中的EGFR的突变状态一致，这些患 者中94%的个体的检测敏感性为66%，特异性为100%。对同一患者的两份血浆进行重复 性实验，结果显示重复性较高，而且突变一致性达到了 97%。通过对人体外周血cfDNA突 变检测已广泛应用于临床指导，cfDNA的突变情况称为肿瘤的一个标志，血浆cfDNA的筛查 成为个性化疾病治疗的趋势。因而，选择cfDNA作为基因检测的样品来源，可以保证肿瘤治 疗在取样信息上的全面精准，且与组织活检相比具有检查微创小、无放射性污染、经济等优 点，并允许对治疗反应进行实时监测。
[0004] 血浆cfDNA提取的质量是对DNA突变检测的保障，目前提取cfDNA的方法主要有 酚氯仿异戊醇法，柱提法，磁珠法。传统的酚氯仿异戊醇法对血浆cfDNA的提取是将血浆 中所有DNA提取出来，不能将血浆中大小片段分离，提取效率低，需借助其他手段提高其效 率。柱提法提取效率高，但也不能将不同大小的DNA片段分离开。磁珠法是利用纳米级磁 珠微珠表面的功能团吸附核酸，利用磁珠与溶液的体积比来对不同大小DNA进行分选，既 可得到较高的回收率，又可以对cfDNA进行分选。研究提示肿瘤患者外周游离DNA片段较 正常人游离DNA小，结肠癌患者血浆中80%以上的游离DNA片段均小于145bp，这提示肿瘤 细胞释放的游离DNA可能小片段比例较大，因此将肿瘤患者外周游离DNA大小片段分离，对 进一步基于外周循环肿瘤细胞细胞DNA监测肿瘤基因信息具有重要意义。
[0005] 游离DNA检测就是对潜在的高危个体筛检、肿瘤的实时监测、预后评估、个体化用 药指导有效的液态活检方法。目前，在肿瘤患者血浆和血清游离DNA中发现存在癌基因的 甲基化、突变及微卫星改变等早期肿瘤细胞DNA的特征。游离DNA的检测被认为是一个潜 在的肿瘤早期诊断和预后判断的有力手段。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、能够分别提取大、小DNA片段的 提取游离DNA的试剂盒。
[0007] 本发明所述的大、小DNA片段是指大于500bp大DNA片段和小于500bp的小DNA 片段。
[0008] 本发明提供的一种提取游离DNA的试剂盒，其含有磁珠、蛋白酶K、异丙醇、 BindingBuffer。
[0009] 本发明的试剂盒还含有标准品，所述标准品为127bp和208bp的人源DNA片段。
[0010] 所述的游离DNA来自外周血或尿液。
[0011] 本发明的试剂盒，其工作程序包括以下步骤：
[0012] (1)分离人类外周血血浆或提取尿液；
[0013] (2) -次结合：按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:10加入蛋白酶K，按照与血浆或 尿液的体积比1:5-1:10加入磁珠，体系中还加入BindingBuffer和异丙醇，异丙醇在整个 体系中的体积比为2% -12%;振荡混匀，整个体系于55°C-60°C加热10_20min，置于磁性 分离器上静置，吸取上清液于另一个容器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到纯化的 500bp以上大小的大片段DNA;
[0014] (3)二次结合：将步骤（2)中的上清液中分别加入磁珠和异丙醇，其中，磁珠与上 清液的体积比为1:15-1:20,异丙醇在整个体系中的体积比为40% -50%;混合均匀后于室 温静置，再于磁性分离器上静置，弃上清液；洗涤磁珠，再经干燥和洗脱得到纯化的500bp 以下大小的小片段DNA。
[0015] 优选地，本发明的试剂盒工作程序包括以下步骤：
[0016] (1)分离人类外周血血浆或提取尿液；
[0017] (2) -次结合：按照与血浆或尿液的体积比1 :5_1:6加入蛋白酶K，按照与血浆 或尿液的体积比1:5-1:6加入磁珠，体系中还加入LysisBuffer和异丙醇，其中Lysis Buffer与血浆或尿液的体积比为2:1-1:1，异丙醇在该体系中的体积比为4% -6 %;振荡混 勾，整个体系于55°C加热10_15min，置于磁性分离器上静置2min，吸取上清液于另一个容 器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到纯化的500bp以上大小的大片段DNA;
[0018] (3)二次结合：将步骤（2)中的上清液中分别加入磁珠和异丙醇，其中，磁珠与上 清液的体积比为1:16-17,异丙醇在整个体系中的体积比为42% -45%;混合均匀后于室温 静置lOmin，在于磁性分离器上静置2min，弃上清液；洗涤磁珠，再干燥和洗脱得到纯化的 500bp以下大小的小片段DNA。
[0019] 在本发明的一个实施例中，对于上述步骤（2)中对磁珠的洗涤、干燥、洗脱方法分 别为：
[0020] 洗涤：（1)加入600y1WashingBufferI，用移液器缓慢吹打磁珠10次；（2)使 充分磁珠重悬。室温放置0.5~lmin。磁性分离，用移液器吸去上清液。重复步骤（1) 一 次；（3)加入800ylWashingBufferII，用移液器缓慢吹打磁珠10次，使磁珠充分重悬。 室温放置0.5~lmin。磁性分离，用移液器吸去上清液。（4)重复步骤（3) -次，尽量除尽 洗涤液。
[0021] 干燥：保持离心管于磁力架上，打开盖子风干至磁珠表面无明显光泽（3~5min)。 干燥时间不宜过长，以防止磁珠干燥过度，造成核酸难以洗脱。
[0022] 洗脱：加入50y1ElutionBuffer。将离心管置于55°C加热lOmin(期间颠倒混 匀一次）。磁性分离，将上清液移至新的离心管，即为纯化得到的游离DNA。
[0023] 进一步地，本发明提供了一种从人类外周血或尿液中提取大于500bp游离DNA的 试剂盒，其工作程序为：
[0024] (1)分离人类外周血血浆或提取尿液；
[0025] (2) -次结合：按照与血浆或尿液的体积比1 :5_10加入蛋白酶K，按照与血浆或 尿液的体积比1:5-10加入磁珠，体系中还加入BindingBuffer和异丙醇，异丙醇在该体系 中的体积比为2% -12%，优选4% -6%;振荡混匀，整个体系于55°C加热10_15min，置于磁 性分离器上静置2min，吸取上清液于另一个容器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到 纯化的500bp以上大小的大片段DNA。
[0026] 本发明提供了一种提取血浆或尿液中游离DNA的方法，包括以下步骤：
[0027] (1)分离人类外周血血浆或提取尿液；
[0028] (2) -次结合：按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:10加入蛋白酶K，按照与血浆或 尿液的体积比1:5-1:10加入磁珠，体系中还加入BindingBuffer和异丙醇，异丙醇在整个 体系中的体积比为2% -12% ;振荡混匀，整个体系于55°C-60°C加热10_20min，置于磁性 分离器上静置，吸取上清液于另一个容器中，收集磁珠进行洗涤、再干燥和洗脱得到纯化的 500bp以上大小的大片段DNA;
[0029] (3)二次结合：将步骤（2)中的上清液中分别加入磁珠和异丙醇，其中，磁珠与上 清液的体积比为1:15-1:20,异丙醇在整个体系中的体积比为40% -50% ;混合均匀后于室 温静置，再于磁性分离器上静置，弃上清液；洗涤磁珠，再经干燥和洗脱得到纯化的500bp 以下大小的小片段DNA。
[0030] 本发明还提供了异丙醇在提取血浆或尿液中游离DNA中的应用。
[0031] 具体地，所述的应用包括以下步骤：
[0032] (1)分离人类外周血血浆或提取尿液；
[0033] (2) -次结合：按照与血浆或尿液的体积比1:5-1:10加入蛋白酶K，按照与血浆或 尿液的体积比1:5-1:10加入磁珠，体系中还加入BindingBuff