陆地棉种子球蛋白基因启动子的克隆及功能鉴定的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及陆地棉种子球蛋白基因启动子的克隆及功能 鉴定。
【背景技术】
[0002] 球蛋白（globulin)是陆地棉（Gossypiumhirsutum)的主要种子贝士藏蛋白， 根据与其它贮藏蛋白的亲缘关系和前原蛋白分子量的不同，可以分为a、0两个家族 (family)。每个家族根据其成员分子量的不同和糖基化位点的有无等特征，又可以分为两 个亚家族（subfamily)。各亚家族成员的代表性基因分别为：GhaGL0A(登录号：M19378)、 GhaGL0B(登录号：M16891)、Gh0GL0A(登录号：M69188)和Gh0GL0B(登录号：M16936)。
[0003] 种子特异性启动子在植物基因工程领域的应用较为广泛：Vasconcelos等人利 用GluB-1启动子的胚乳特异性转录活性，驱动大豆（Glycinemax)ferritin在转基因水 稻（Oryzasativa)谷粒中特异性表达，提高了其铁和锌的含量。Sunilkumar等人利用陆 地棉GhaGL0B启动子构建了 5 -杜松砲稀合成酶（8-cadinenesynthase)基因的RNAi 载体，成功地将转基因棉花种子中棉酸（gossypol)的含量由对照的10. 45yg/mg降低至 0. 46yg/mg。除在改善和提高种子营养品质中的应用以外，种子特异性启动子还广泛应 用于基于转基因植物种子的植物生物反应器（plantbioreactor)，以表达如人血白蛋白 (humanserumalbumin,HSA)、人凝血因子9(humancoagulationfactorIX，hFIX)等药用 蛋白。
[0004] 在种子特异性启动子的应用实践中，选择适当的启动子以驱动外源基因的定时、 定位和适度表达是成功的关键因素。因此，除了现有的0-phaseolin启动子、Dc3启动子、 棉花胚胎后期丰富（lateembryogenesisabundant)蛋白D113启动子等，进一步发掘新的 驱动目的基因转录特异性强、转录强度适宜的种子特异性启动子，对于丰富启动子来源、多 基因叠加复合性状育种、避免转基因沉默等具有一定的现实意义。
[0005] 种子藏蛋白（seedstorageprotein)在种子发育过程中高水平表达，由于其编 码基因的转录受到启动子严格的时空特异性调控，因而被认为是种子特异性启动子的重要 来源。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种DNA分子。
[0007] 本发明提供的DNA分子，是如下1)-5)中任一种的DNA分子：
[0008] 1)为序列表中序列1第1-1668位核苷酸所示的DNA分子；
[0009] 2)为序列表中序列2第1-1647位核苷酸所示的DNA分子；
[0010]3)为序列表中序列3第1-1664位核苷酸所示的DNA分子；
[0011] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白 质的DNA分子；
[0012] 5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0013] 上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0? 1 %SDS和 1XSSC，0? 1 %SDS各洗膜一次。
[0014] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0015] 扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
[0016] 上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在驱动植物特定 组织中目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。
[0017] 上述应用中，所述特定组织为种子。
[0018] 上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
[0019] 上述应用中，所述双子叶植物为十字花科植物，所述十字花科植物具体为拟南芥。
[0020] 本发明的实验证明，本研究所克隆启动子pGhaGLOA、pGh0GL0A和pGh0GL0B， 在成体植株各部位均表现有一定量的GUS活性，但相对于其在种子中的活性差异极大。综 合考虑在转基因拟南芥成体植株不同器官中GUS的酶活，认为本研究所克隆的三个陆地棉 种子球蛋白基因启动子pGhaGLOA、pGh0GL0A和pGh0GL0B为种子特异性启动子，其中 pGhaGL0A的启动子转录活性和特异性最好。陆地棉种子特异性启动子的克隆可为利用基 于转基因植物种子表达系统的植物生物反应器平台生产功能蛋白奠定基础；同时，可为开 展种子特异性启动子顺式作用元件等相关研究工作提供基础条件。
【附图说明】
[0021] 图1为⑶S转基因拟南芥PCR鉴定的部分结果。
[0022] 图2为不同启动子驱动⑶S在拟南芥种子中表达的酶活。
[0023] 图3为⑶S转基因拟南芥⑶S染色结果。
[0024] 图4为不同苗龄幼苗中⑶S的酶活。
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]陆地棉（Gossypiumhirsutum)品种'河字 312'（Coker312)，记 载在如 下文南犬中：Effectsofhygromycinoncottonculturesandits applicationinAgrobacterium-mediatedcottontransformation[J].InVitro Cellular&DevelopmentalBiology-Plant. 2007, 43 (2):111-118。
[0028] 拟南芥（Arabidopsisthaliana)哥伦比亚生态型（Columbia,Col)，记载在如下 文献中：拟南芥PMRP的表达特性及功能分析，中国农业科学，2014, 47 (15) : 3094-3102,以 下称为野生型拟南芥。
[0029] 大肠杆菌菌株Trans5a、BL21 (DE3)购自北京全式金生物技术有限公司，货号分 别为CD201-01、CD601-01。
[0030] 农杆菌菌株GV3101: :pMP90购自北京华越洋生物科技有限公司，货号：GT707s。
[0031] PENTR-P35S::⑶S载体按照如下方法构建：
[0032] 1、合成linker-1/2
[0033] linker-1
[0034] AATTCGCCCTTGCGATCGCATGCGACTGCGGCCGCTCAGTGCACCCGGGCATGTCATGGCGCGCCAAGG GCG
[0035] linker-2
[0036] GCGGGAACGCTAGCGTACGCTGACGCCGGCGAGTCACGTGGGCCCGTACAGTACCGCGCGGTTCCCGCT TAA
[0037] 2、用EcoRI对Invitrogen公司产品pCR'sl8/GW/TOP〇sl (货号：K250020SC)进行酶 切。
[0038] 3、linker-1/2退火形成具有粘性末端的双链后，连入pClT8/GW/T0Pae的酶切后 载体大片段，命名为PENTR-MCS。
[0039] 4、用T35S(F)AR)对pCAMBIA2300 进行PCR扩增，获得CaMV35S终止子；
[0040] T35S(F):CCCGGGCGGCCATGCTAGAGTCCGCA
[0041] T35S(R):GGCGCGCCATGTCACTGGATTTTGGTTT
[0042] pCAMBIA2300 记载在如下文献中：Productionofearlyfloweringtransgenic barleyexpressingtheearlyfloweringalleleofCryptochrome2gene.GM Crops. 2011, 2(1) :50-7.doi:10. 4161/gmcr. 2. 1. 15627.
[0043] 5、将CaMV35S终止子和pENTR-MCS用Xmal/AscI双酶切，将CaMV35S终止子连入 pENTR-MCS的酶切后载体大片段，命名为pENTR-MCS-T35S;
[0044] 6、用引物P35S(F)/P35S(R)对pM0N82053 进行PCR扩增，获得P35S;
[0045] P35S(F)：GCGATCGCGTCCGATGTGAGACTTTTC
[0046] P35S(R)：GCGGCCGCCCTCTCCAAATGAAATGAAC
[0047] pM0N82053 记载在如下文献中：ExpressionoftheArabidopsisthaliana BBX32geneinsoybeanincreasesgrainyield.PLoSOne.2012 ；7(2):e30717. doi:10.1371/journal,pone. 0030717〇
[0048] 7、将P35S和pENTR-MCS-T35S用AsiSI/Notl双酶切，将P35S连入pENTR-MCS-T35S 的酶切后载体大片段，命名为PENTR-P35S。
[0049] 8、用引物⑶S(F)/⑶S(R)对pBI121进行PCR扩增，获得⑶S片段；
[0050] ⑶S(F):GCGGCCGCATGTTACGTCCTGTAGAAAC
[0051] ⑶S(R):CCCGGGTCATTGTTTGCCTCCCTGCT
[0052] pBI121 记载在如下文献中：Completesequenceofthebinaryvector pBI121anditsapplicationincloningT-DNAinsertionfromtransgenicplants. MolecularBreeding, 2003, 11(4):287-293.
[0053] 9、将⑶S片段和pENTR-P35S用Notl/Xmal双酶切，将⑶S片段连入pENTR-P35S 的酶切后大片段，命名为PENTR-P35S::⑶S。
[0054] pEarleyGate303 载体记载在如下文献中：Gateway-compatiblevectorsfor plantfunctionalgenomicsandproteomics.ThePlantJournal, 2006, 45(4):616-629. D0I:10. 1111/j. 1365-313X. 2005