一种栉孔扇贝生长性状相关的snp位点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子育种遗传标记筛选技术领域，具体涉及一种栉孔扇贝生长性状相 关的SNP位点及其检测和应用。
【背景技术】
[0002] Smad家族是一类细胞质内信号转导分子，在转化生长因子0(transforming growthfactor0，TGF-0)/Smad信号通路中具有重要的信号转导作用。来自TGF-0 超家族成员的信号作用于II和I型丝氨酸/苏氨酸激酶受体后，经Smad直接转导入 细胞核内，对生物体细胞增殖、分化和生长等过程进行调控。目前，哺乳动物中已发 现至少8种不同的Smad蛋白，根据其在信号转导过程中作用的不同，可分为3类：受 体调节型Smad(receptor-regulatedSmads，R-Smad)、通用型Smad(common-partner Smads,Co-Smad)和抑制型Smad(inhibitorySmads,I-Smads) 〇
[0003] 目前，对Smad家族基因的研究主要集中在脊椎动物，在双壳类动物中也有少量报 道，并且发现Smad具有调节双壳类的生长的功能。栉孔扇贝是我国重要海产经济贝类，培 育生长性状优良的高产品种是提高其经济效益的重要途径之一，获得与扇贝生长性状相关 的基因及基因位点可辅助高产扇贝的选育。目前，在扇贝中与生长相关的基因及基因位点 的报道较少，且未见Smad家族基因相关研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种栉孔扇贝生长性状相关的SNP位点及其检测和应用，即 通过克隆栉孔扇贝Smad基因，并筛查出基因中与体重、软体重和横纹肌重等重要生长性状 相关的SNP位点，为尚广f节孔扇贝的选育提供分子标记。
[0005] 本发明首先提供一种栉孔扇贝Smad3基因（CfSmad3)，该基因编码的氨基酸序列 为SEQIDN0:1 ;
[0006] 所述的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:2 ;
[0007] 本发明另一个方面提供一种与栉孔扇贝生长性状相关的SNP位点，所述的位点为 核苷酸序列为SEQIDN0:2的CfSmad3基因的846位，其碱基为G或T;
[0008] 本发明还提供用于检测上述SNP位点的探针及分型引物：
[0009] 探针Smad3pbl(SEQIDN0:3)
[0010] 5r -CAACATCAATCGGACCCAGCAGGTGCT-3r ；
[0011] 分型引物为Smad3sfl(SEQIDN0:4)
[0012] 5r -TACTGTAGATGGGTTCACCGATCCC-3r ；
[0013] Smad3srl(SEQIDNO:5)
[0014] 5， -TACCAATGTGGCGTCTCGTCATCTC-3'。
[0015] 本发明提供的SNP位点用于栉孔扇贝的亲本选育。
[0016] 通过对CfSmad3基因的转录序列进行测序和Clustal比对，筛查SNP位点。运用 高分辨率恪解曲线（Highresolutionmelting,HRM)技术在f节孔扇贝群体中检测位点多态 性，并分析位点基因型频率与扇贝生产性状间的相关性。位点C. 846G>T与栉孔扇贝体重、 软体重和横纹肌重等重要生长性状显著相关，GG型个体的上述生长性状均显著高于GT型 个体（P〈0. 05)。因此，在生产中可优先选择在该位点基因型为GG型的个体，作为高产扇贝 选育的亲本或者进行规模养殖，避免选择该位点为GT型个体作为亲本或者进行规模养殖， 也应避免选择该位点分别为TT型和GG型的亲本进行杂交。
【具体实施方式】
[0017] 本发明选择Smad3基因高度保守区域设计简并引物扩增目的基因片段，利用cDNA 末端快速扩增（RACE)技术获得该基因的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1501bp，其中 0RF长度为1248bp，编码415个氨基酸，预测蛋白分子量46. 86KD，等电点为6. 52 ;5'UTR长 度为139bp，3'UTR长度为114bp。蛋白序列中包含Smad家族蛋白2个特征性保守域MH1 和MH2,分别在第26-134和220-391位氨基酸处。
[0018] 通过对CfSmad3基因的转录序列进行测序和Clustal比对，筛查SNP位点。运用 高分辨率恪解曲线（Highresolutionmelting,HRM)技术在f节孔扇贝群体中检测位点多态 性，并分析位点基因型频率与扇贝生产性状间的相关性。位点C. 846G>T与栉孔扇贝体重、 软体重和横纹肌重等重要生长性状显著相关，该位点可用于栉孔扇贝的分子标记辅助育 种。
[0019] 下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0020] 实施例1
[0021] 本发明中的CfSmad3基因cDNA序列克隆包括下列步骤：
[0022] a)栉孔扇贝横纹肌总RNA的提取；
[0023]b)cDNA第一链的合成；
[0024]c)目的基因片段的克隆；
[0025] d)目的基因全长cDNA序列的获得；
[0026]e)目的基因的生物信息学分析。
[0027] 具体操作如下：
[0028]a)栉孔扇贝总RNA的提取。按照Trizol方法从栉孔扇贝横纹肌中提取总RNA。
[0029]b)cDNA第一链的合成。以2yg总RNA为模板，分别加入lyl20yM01igod⑴18， RNase&DNase-freeH20补足至13yl，混勾离心。70°C保温10min，立即置于冰上，以打开 RNA二级结构。依次加入：5yl5XM-MLVBuffer，5yldNTP(2.5mM)，lylRNasin(40U/ yl)，lylM-MLV(200U/yl);混匀离心后，42°C，90min。94°C，5min，以灭活反转录酶。分 装后-20°C保存。
[0030]c)目的基因片段的克隆。根据已报道的合浦珠母贝、斑马鱼、非洲爪蟾、原鸡、小 鼠和人类等物种的Smad3基因cDNA及氨基酸序列，选择保守性高的区域设计简并引物：Sma d3-fl:5'-ACIGTIGAYGGITTYACIGAYCC- ;Smad3-rl:5'-CATICKDATIGTRCACATICKIGT-3'。以 栉孔扇贝横纹肌cDNA为模板，进行40y1大体系扩增。1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR产 物，UNIQ-10柱式胶回收试剂盒回收目的片段。再与pMD18-T载体（大连宝生物工程有限 公司）连接，参照《分子克隆第三版》（黄培堂译，科学出版社，2002年）的方法转化大肠杆 菌DH5a。菌落PCR检测后，挑取阳性克隆，接种于600y1LB液体培养基（含氨苄青霉素） 中，37°C、约200rpm振荡培养过夜，送上海Sanger公司测序。在GenBank蛋白数据库中对 测序结果与已知序列作BlastX同源性分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)。 [0031]目的基因片段扩增，利用40yL反应体系：
[0032]
[0033]扩增所用PCR反应程序：94°C5min;94°C30s，58°C退火 30s，72°C30s，30 次循环； 72°C5min〇
[0034] d)目的基因全长cDNA序列的获得。根据已获得的cDNA片段，利用Clontech公 司SMART?RACE试剂盒构建5'RACE和3'RACE文库。用PrimerPremier5. 0分别设计目 的基因RACE引物，3'RACE引物：5' -ACGATTGTACTACATCGGAGGCGAGGTG-3'和5'RACE引物： 5' -TTACCAATGTGGCGTCTCGTCATCTCC-3'。分别利用3'RACE引物和5'RACE引物与接头引物 NUP(5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT- 3'）进行3'末端和5'末端的扩增。PCR产物用1. 2% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒（上海生工）进行PCR产物纯化，再与pMD18-T 载体（大连宝生物工程有限公司）连接，参照《分子克隆第三版》（黄培堂译，科学出版社， 2002年）的方法转化大肠杆菌DH5a。菌落PCR检测后，对5'RACE和3'RACE，各挑取3个 阳性克隆进行测序，将5'RACE和3'RACE测序获得的序列两端拼接后得到cDNA全长序列， 见SEQIDN0. 2,编码的氨基酸序列为SEQIDN0.1。
[0035] 3'和5'末端扩增，利用40yL反应体系：
[0036] 5'（3,）-RACE-ReadycDNA2. 0y1
[0037] 10XAdvantage2PCRbuffer4. 0u1
[0038] lOmMdNTPMix3. 2y1
[0039] 10XUPM4. 0y1
[0040]