猪肉质性状相关基因Myo6的分子克隆及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜分子生物学技术领域，涉及一种包含如SEQIDNO: 1所示猪基因 核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQIDNO: 1所示的My〇6基因的分子克隆方法及多 核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。
【背景技术】
[0002] 猪肉是动物性蛋白的主要来源，随着人们对肉需要量的增加，对肉质的要求也相 应提高。影响猪肉质的因素有遗传和非遗传的，猪肌内脂肪含量对肉质性状有很大的影响， 一般来说，肌内脂肪含量越高，猪肉质越嫩，从而肉质越好。肉质性状大多属于数量性状，由 微效多基因控制。许多肉质性状只能在动物屠宰后才能测定，所以常规选育只能进行同胞 或半同胞测定，这样必增加选育成本，且遗传进展缓慢。猪基因组草图的构建，使得寻找影 响肉质性状的主基因或与其紧连锁的分子标记成为可能，这些分子标记一经确认，就可进 行标记辅助选择育种。利用分子标记进行辅助选择（MAS)进行肉质性状改良是一种有效的 途径。
[0003]Myo6(Myosin6,肌球蛋白6)属于肌球蛋白家族。肌球蛋白家族是一大类依赖ATP 的机械酶，存在于所有的真核细胞中，利用ATP水解产生的动力沿着肌动蛋白丝运动，其最 早被认识的生理作用是参与肌肉的收缩，而近年来发现众多肌球蛋白在细胞运动、细胞分 裂，信号传导等发挥重要的作用。参与肌肉收缩的双极性肌丝的肌球蛋白被称为常规肌球 蛋白；这些肌球蛋白没有双极性肌丝，也称为非常规肌球蛋白，My〇6是非常规肌球蛋白基 因家族中的一员。
[0004] My〇6基因其多种功能而受到多种领域学者的关注，如在果蝇中发现它参与精子的 产生、非对称细胞分裂中纺锤体的旋转，而在哺乳动物细胞中，My〇6参与细胞的内吞作用、 高尔基体的维持，还和人类听觉相关等等。
[0005] My〇6基因在进化中十分保守，在线虫到人类的很多物种中均有表达，它位于人染 色体6ql3、小鼠染色体9E1、野鸡3号染色体、猪1号染色体。目前国内外关于人类、鼠、果 蝇等的My〇6基因及其编码蛋白的功能、调控机理都研究得比较深入。但是，关于猪My〇6基 因的研究报道很少。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克隆猪My〇6基因cDNA分子，寻找My〇6基因的突变位点以及基 因多态性的检测方法，为猪肉质性状标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
[0007] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种猪肉质性状 相关基因My〇6的分子克隆及应用，为猪肉质性状标记辅助选择提供有用的分子标记。
[0008] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：以人的Myo6基因序列（GenBank 收录号为NC_000006. 12)为种子序列，在GenBank中利用BLASTN(BasicLocalAlignment SearchToolNucleotide)，参照其同源性在 80% 以上的猪EST(ExpressionSequence Tags)设计特异引物，利用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnd)，克隆出猪Myo6 基因cDNA全长，该猪Myo6基因的DNA序列如SEQIDNO: 1所示。Myo6基因的多态性是利用比 较基因组学方法根据人的My〇6基因序列设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片 段利用测序筛选SNP，并利用PCR-RFLP进行基因分型技术，发现第709bp处有一个G/A的 碱基突变，导致PCR-RFLP-XbaI多态性。
[0009] 试验材料：25日龄沙子岭猪由湖南省湘潭市沙子岭猪资源场提供，取背最 长肌-80°C保存，5 '-RACEVersion2. 0 试剂盒购于Invitrogen公司，3 '-RACE SMARTer?RACEcDNAAmplificationKit试剂盒购于Clontech公司。
[0010] 总RNA提取与cDNA第1链的合成：用SUPERSCRIPTIIRT酶和引物GSP1对总RNA 进行基因第一链cDNA的合成，使用RNaseMix对合成的cDNA进行去RNA处理，最后对cDNA 进行纯化。
[0011] 引物设计：据GenBank人Myo6基因（登录号：NC_000006. 12)序列保守区设计引 物，引物设计的软件为Premiere5. 0,引物设计的原则是特异性引物长度在23-28个核苷 酸，GC含量在50% -70%，退火温度在65-70°C，使用巢式PCR进行扩增。
[0012] 编码序列PCR扩增：以合成的猪cDNA为模板，在保守区设计引物经过克隆测序，获 得该基因部分⑶S序列。
[0013] 5 ^ -RACE扩增：使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上多聚C，使用引物 GSP2(Gene_SpecificPrimers)和试剂盒中的桥连铆钉引物AUAP(表1)对已经加dC尾的 cDNA进行PCR第一轮扩增；使用引物GSP3和试剂盒里中的桥连通用扩增引物AUAP进行巢 式PCR第二轮扩增，将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，纯化后的 PCR产物与pMD18-T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序，获得目的序列。
[0014] 3'-RACE扩增：使用引物 3' 452-1 和UPM(UniversalPrimerAMix)，以上面 合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物 3' 452-2和UPM(表1)进行第二轮PCR扩增。将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带 进行切胶回收纯化。纯化后的PCR产物与pMDIST进行连接，转化后挑取阳性克隆测序。
[0015] 将扩增得到的5' -RACE长度为526bp、3' -RACE扩增得到的长度2264bp和中间 序列拼接得My〇6基因的全长cDNA序列，从而完成本发明的My〇6基因的克隆的内容。
[0016] 表1本发明中使用的引物序列
[0017]
[0018] 以下为My〇6基因分子标记的筛选。
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[0019] DNA样品：取小块猪耳组织提取DNA，共6个品种：大白猪167头，桃源黑猪58头、 沙子岭猪100头、浦市铁骨猪74头，宁乡猪196头和大围子猪228头，共计823头。
[0020] 引物设计：利用比较基因组学方法根据人的My〇6基因（GenBank收录号为NC_000006. 12)的第11外显子至第12外显子之间，以该基因在GenBank作BLAST，序列比 对后筛选出候选SNPs位点，运用PCR-RFLP技术验证该位点。
[0021] 制备了检测上述序列表SEQIDN0:1基因片段突变的引物对，所述引物 对，正向引物为 5 ' -ACTACGGGAACTCCAACC-3 '(见SEQIDN0 :2)，反向引物为 5' -ACTTAACCAAATGCCACC-3，（见SEQIDN0:3)。
[0022] PCR条件：PCR反应体系（总体积 20yL) : 10XBuffer2yL、2mmol/LdNTPs 1.6 1^、20臟〇1/1]\%(：121.6 1^、了39 0嫩聚合酶（51]/1^)0.41^、0嫩模板（100即/ 1^)11^、上下游引物（10口111〇1/1^)各0.41^、及(1(111 20 12.6 1^。
[0023] 反应程序：94°C预变性7min;94°C变性45s，59°C退火30s，72°C延伸45s，共30个 循环；72°C后延伸7min，最后4°C保存。
[0024] 取10yLPCR扩增产物，加2yL溴酚蓝上样缓冲液混匀后，点样于2%的琼脂糖凝 胶（含 0. 05%EB)上，然后点 6yL100bpDNAMarkers作为参照。5V/cm电泳 0. 5-1.Oh。 电泳结束后在凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照，结果如图1所示。将纯化后的PCR产 物后送铂尚生物技术公司测序。
[0025] PCR产物的XbaI酶切：
[0026] 在10yLPCR产物中加入0.8yL10X内切酶缓冲液、0.2yL限制性内切酶和 1yL双蒸水，总体积为12yL，37°C消化4-10h。A/G位点用2%琼脂糖凝胶电泳分析，5V/ cm电压电泳0.5h，紫外灯下观察结果并拍照，酶切结果如图2,扩增产物进行测序，序列 如SEQIDN0 :1所