使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及建立遗传修饰动物模型的方法，特别涉及使用单倍体干细胞高效建立 遗传修饰动物模型的方法。
【背景技术】
[0002] 哺乳动物胚胎干（ES)细胞具有自我更新（Self-renewal)的特性和多向分化的潜 能（Pluripotency)，它既是再生医学研究和未来临床细胞治疗中的重要资源，也已经成为 分子遗传学领域的重要研究工具，被广泛用于遗传修饰动物模型的构建。
[0003] 传统的用于制作遗传修饰动物的方法是用基因打靶的方法对二倍体ES细胞进行 遗传修饰，再将经过特定遗传修饰的ES细胞注射到发育的二倍体囊胚中以生成嵌合体动 物及进入生殖系的基因修饰动物 ' 该方法已经在制作完全基因敲除或者条件性基因敲 除小鼠方面得到了广泛应用。它通过在小鼠模型中有针对性地敲除某个或某几个基因以 研究这些基因的在体功能，有助人们了解基因在胚胎发育及疾病发生发展过程中的作用， 然而该方法必须首先在ES细胞中进行基因打靶，ES细胞的培养与遗传操作需要丰富的经 验，这使得这一技术方法的应用具有很大的局限性。此外，某些动物还不能实现ES细胞的 分离建系，也就无法使用基因打靶及囊胚注射的方法制作基因修饰动物。由于是二倍体ES 细胞，该方法制作基因敲除小鼠时，需小鼠经过多次交配繁殖才能得到纯合突变小鼠，耗费 大量的人力物力，且耗时较长，需要至少6个月的时间，这在一定程度上限制了该技术在 基因功能研究中的应用。生殖系传递是决定能否获得目标小鼠的关键因素。生殖系传递 的效率往往与ES细胞状态、细胞遗传背景、核型、小鼠状态及嵌合体小鼠嵌合率的高低相 关。具有极大的不稳定性，在某些情况下甚至无法获得进入生殖系的目标小鼠。四倍体补 偿（Tetraploidcomplementation)技术可以在一定程度上解决上述问题。四倍体胚胎是 发育缺陷的，只能形成胚体外的胎盘组织，当将二倍体ES细胞或诱导多能干细胞（Induced pluripotentstemcell，iPSC)注射到四倍体囊胚时可以发育成来自二倍体细胞的动物个 体，它常用于证明二倍体多能干细胞的全能性 72。这就是四倍体补偿技术。小鼠ES细胞经 遗传修时候再通过四倍体补偿技术即可获得经过人为修饰的目的小鼠。这种方法不需要经 过嵌合体小鼠阶段，可以直接获得基因修饰小鼠，缩短了实验周期，节约了科研成本。同时 该技术较易获得不同发育期的胚胎，在胚胎致死基因功能研究中有重要应用。然而，由于该 技术用来制作基因修饰小鼠需要较多操作环节，如ES细胞的培养与基因修饰、四倍体胚胎 的获得与体外培养、囊胚注射、小鼠交配等，目标小鼠的获得效率较低，国际上尚未普及此 技术。
[0004] 近年来研究人员成功实现了将小鼠的ES细胞或iPS细胞体外转化为生殖细胞，并 最终培育出具有生殖能力的健康小鼠73' 74。2011年，KatsuhikoHayashi等使用特定的培 养条件将培养的小鼠ES细胞或iPS细胞分化形成原始生殖细胞样细胞（PrimordialGerm Cell-LikeCells，PGCLCs)，并将其植入不能生育的小鼠睾丸中，产生了外观正常的精子。 再通过胞衆内精子注射（IntracytoplasmicSpermInjection,ICSI)的方法将这些精子注 射到雌性小鼠的卵细胞中，最终产下了可育的健康小鼠后代73。2012年，同一研究小组成功 地将雌性ES细胞或iPS细胞诱导成PGCLCs，并将这些细胞与雌鼠性腺细胞共培养，创造一 个再造的卵巢。当将再造卵巢移植到小鼠卵巢囊时，PGCLCs成熟为生发泡期卵母细胞，成 熟的卵母在细胞进行体外受精后可以生成健康可育的后代74。使用胚胎干细胞制造出"人 造精子"或"人造卵子"是生物医学领域的巨大突破，这也为男性不育或女性不孕症的治疗 带来了希望。但这项技术要应用到人类还有很长的路要走，需要进行更多的研究和探讨伦 理学的问题。此外，这项成果也为制作基因修饰动物提供了新思路。可以将经遗传修饰的 ES细胞或iPS细胞诱导成PGCLCs，进而在体生成携带遗传修饰的精子或卵母细胞，进而通 过体外受精的方法得到遗传修饰小鼠。该方法有很好的前景，但是操作难度较大，目前还难 以广泛使用。
[0005]近几年，CRISPR_Cas9基因组编辑技术被用于高效地制作基因修饰动物75。该方 法通过将Cas9mRNA和sgRNA共注射到受精卵细胞质中实现定点基因修饰。Cas9切割基因 组后引起DNA双链断裂，当通过NHEJ进行修复时，可以引起断裂点发生几十到几百个基因 的插入或缺失；若在同源模板存在的条件下可以通过HDR进行精准修饰，纠正突变或者插 入一段序列。该方法用于制作基因修饰动物的优点是不需要对ES细胞进行遗传操作，越过 了ES细胞这一障碍，只需要对受精卵进行注射，操作性较强。这对不能建立ES细胞系的动 物进行遗传修饰有重要的价值。由于直接对受精卵进行遗传操作，可以直接得到纯合子突 变动物，不需要经过长期的动物交配，也没有生殖系传递的限制，缩短了实验周期，节约了 人力物力。而且该方法可以同时进行多个基因修饰，可以用于制备多个基因同时敲除的动 物模型，以研究多个基因功能的相关性或者存在冗余现象的基因 75。但是CRISPR-Cas9系 统可能存在脱靶效应，造成靶位点之外的区域发生突变。这提示人们使用该方法进行遗传 修饰时需谨慎，注意检测是否存在脱靶效应，以明确目的基因突变和表型之间的因果关系。 目前，有研究将将Cas9蛋白的HNH或RuvC样结构域进行突变，使其产生单链断裂切割突变 型，有效降低了脱靶效应 ' 另外，利用此技术难以制作基因组大片段删除、外源DNA定点 敲入（Knock-in)，等遗传修饰动物。
[0006] 近年来，小鼠孤雄单倍体（Androgenetichaploid,AH)ES细胞系的成功建立，为遗 传修饰小鼠的构建提供了全新的途径。将单倍体ES细胞在体外进行遗传修饰后，通过胞质 内孤雄单倍体ES细胞注射（IntracytoplasmicAH-ESCsinjection,ICAHCI)注入到卵母 细胞中，将这种重组形成的二倍体胚胎移植回代孕鼠子宫，可以发育成为携带遗传修饰的 "半克隆"（Semicloned,SC)小鼠。此方法的优势在于：首先，生成的SC小鼠相当于上述传 统方法获得的杂合突变小鼠，由此跳过了生殖系传递这一限速步骤，实验结果不再取决于 生殖系传递的成功与否；其次，从进行ICAHCI到生成SC小鼠，仅需一个繁殖周期（20天）， 极大地提高了实验的效率并节约资源。已有的实验结果表明，虽然AH-ES细胞能够获得可 育的SC小鼠，但仍存在一些问题：第一，约有半数的新生小鼠呈现发育异常状态，个体明显 较小，在出生后很快死亡；第二，与精子对照相比，AH-ES细胞获得的胚胎出生百分比及活 至成年小鼠的百分比均显著降低；第三，高代数的单倍体细胞及经过遗传修饰的单倍体细 胞克隆均难以获得健康的SC小鼠，也就是说目前利用该方法构建遗传修饰小鼠并没有实 用性。
[0007] 人们已经对SC小鼠发育异常的原因进行了初步的研究。通过对异常小鼠一些印 记基因座（Imprintedgenes)的DNA甲基化状态分析显示：H19区域的甲基化印记发生了 丢失，导致Igf2的异常低表达；而正常个体H19区域存在父源甲基化状态从而保持了Igf2 的正常表达。结合已有的基因印记研究结果，我们推测导致AH-ES细胞无法支持胚胎正常 发育的主要原因可能就在于H19基因的印记状态与精子不一致。由此我们提出本研究的设 想：通过人为修正AH-ES细胞中的H19-Igf2印记基因座，使得其维持稳定的基因组印记状 态，从而保证高效获得遗传修饰SC小鼠的能力。
【发明内容】
[0008] 首先，我们利用CRISPR_Cas9辅助的高效同源重组技术，在小鼠AH-ES细胞中进行 了H19基因及其上游DMR的敲除，通过长片段PCR和Southernblot杂交实验证明了敲除 的正确性。同时选取8个具有代表性的潜在脱靶位点进行分析，在细胞克隆中未发现存在 CRISPR-Cas9导致的脱靶现象。H19敲除后的ES细胞群体内仍存在一定比例的单倍体，并 可被连续的流式分选所富集；细胞高表达干细胞标志物0ct4、Sox2、Nanog和SSEA1 ;碱性磷 酸酶染色呈阳性；H19被敲除后其表达量下降为零，而Igf2表达量大幅上升；连续培养传代 后的单倍体细胞能够在体外分化形成拟胚体（EB)及形成嵌合体小鼠，表明其具有良好的 多潜能性。然后，我们利用H19敲除的小鼠AH-ES细胞系进行ICAHCI注射，生成了三只健 康的SC小鼠，未出现发育异常现象，其中2只活到成年并能繁育后代。上述结果充分证明 了我们设想的正确性，我们建立的H19敲除小鼠AH-ES细胞系可用来快速高效地制作基因 修饰小鼠，是一种行之有效的新的生物技术。
[0009] 我们的工作表明H19敲除小鼠AH-ES细胞系一方面具有良好的稳定性，印记状态 可长期保持在与精子类似的水平，不因长期的培养传代和连续的遗传操作而改变；另一方 面又具有较强的类似"精子"活力，可以代替精子行使生殖功能，突破了精子不能进行细胞 分裂更无法进行遗传操作的限制。这为未来可能建立的人孤雄单倍体ES细胞系研究提供 了启发，在健康生殖医学领域有重要的价值。
[0010] 本发明提供使用单倍体干细胞高效建立遗传修饰动物模型的方法，其包括：
[0011] a)使用同源重组敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因；
[0012] b)筛选和鉴定正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞；以及
[0013]c)将所述正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞注射到卵母细胞胞质中，以 产生半克隆的遗传修饰动物。
[0014] 在本文中，单倍体干细胞等同于孤雄单倍体胚胎干细胞。本文所使用的孤雄胚胎 干细胞均来自不包含人的哺乳动物。
[0015] 所述孤雄单倍体胚胎干细胞仅携带单倍染色体，不能发育成完整的动物个体，因 此不属于动物品种范畴。
[0016] 优选地，所述同源重组方法为CRISPR_Cas9方法，优选在步骤a)中使用 CRISPR-Cas9方法辅助同源重组以高效敲除孤雄单倍体胚胎干细胞的H19基因。
[0017] 优选地，在步骤a)中使用含有PGK-neo药物筛选元件的构建体，并在步骤b)中使 用G418药物筛选敲除H19基因的单倍体胚胎干细胞。
[0018] 优选地，在步骤在于在步骤a)中将打靶构建体pCCI-H19、Cas9-sgRNA_4和 Cas9-sgRNA-7质粒通过CRISPR-Cas9方法以电转染的方式导入单倍体胚胎干细胞中以敲 除H19基因，优选地敲除H19基因及其上游DMR。
[0019] 优选地，在所述方法的步骤b)筛选和鉴定正确敲除H19基因的单倍体胚胎干细胞 的方法选自以下方法中的一个或多个或其组合：用于验证打革E1正确性的Southernblot、用 于确定基因组范围基因拷贝数变异的比较基因组杂交、潜在脱靶位点鉴定、检测干细胞标 志物0ct4、Sox2、Nanog和SSEA1的表达、拟胚体形成实验、嵌合体小鼠实验、检测印迹基因 H19、Igf2表达量。
[0020] 所述方法进一步包括通过流式分选将所述正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎 干细胞分选出，并在连续的传代中富集所述确正确敲除H19基因的孤雄单倍体胚胎干细胞 的步骤。
[0021] 根据本发明的方法，其中所述动物选自不包括人的哺乳动物，优选为啮齿类或灵 长类哺乳动物，更有优选为小鼠、大鼠、食蟹猴，最优选为小鼠。
[0022] 根据本发明的方法，所述单雄单倍体胚胎干细胞选自EG-1或0G-3小鼠单倍体胚 胎干细胞，优选0G-3小鼠单倍体胚胎干细胞。
[0023] 另一方面，本发明还提供一种H19基因敲除的小鼠单倍体胚胎干细胞系。
[0024] 再一方面，本发明还提供所述的小鼠单倍体胚胎干细胞系在建立遗传修饰动物模 型中的应用。
[0025] 本发明还提供小鼠单倍体胚胎干细胞系在用于治疗雄性动物不育或遗传病的试 剂盒中的应用。
【附图说明】
[0026]图 1A和图 1B。图 1A为pCCI18 图谱。Hprt-left-arm和Hprt-right-arm为HPRT 打靶同源臂，两同源臂之间携带PGK-puro-deltaTK药物筛选元件。图1B为pL452图谱。质 粒携带PGK-neo药物筛选元件。
[0027] 图2为aCGH数据分析流程图。
[0028] 图3为px330的基本结构。px330为Cas9与guideRNA的联合表达质粒，包含U6 启动子，BbsI酶切位点，CBh启动子，核定位信号NLS，Cas9表达元件。
[0029] 图4为pCCI-H19_neo打靶载体结合CRISPR_Cas9进行基因敲除结构示意图。 sgRNA-7,sgRNA-4为左右两侧设计的两个Cas9切割位点。Probe-R为Southernblot所用 探针，B为BglII酶切位点。
[0030] 图5为测量分析实验鉴定CRISPR_Cas9切割活性。上图为左同源臂的4个备选位 点，下图为右同源臂的4个备选位点。对照为野生型基因组对照，其中sgRNA-1与sgRNA-2， sgRNA-7与sgRNA-8因位置较为接近，共用一个对照。野生型对照无法被T7EN1切开而产 生多个条带，而发生CRISPR-Cas切割的样品可被T7EN1切割形成较小的条带。如图所示， sgRNA-4和sgRNA-7出现最为明显的小条带，证明切割效率较高。
[0031] 图6为Southernblot实验验证打革巴的正确性。
[0032] 图7为H19A克隆的流式分选图。
[0033] 图8为H19A1和H19A2的CGH结果展示图。染色体按序号依次排列在横坐标上， 纵坐标为Log2_Ratio(H19A /0G-3)。基线代表无变异，基线上方和下方离横轴较近的散点 或区域分别代表基因组在相应位置的扩增和缺失。扩增区域上方或缺失区域下方的实线是 对变异区域的展示，不代表数值大小。两株细胞系X染色体整体显示有下移，但Log2_Ratio数值很小，不能认为存在缺失。
[0034] 图9为H19A细胞的干细胞标志物免疫荧光检测。标尺为20ym。
[0035] 图10A和图10B为0G3细胞和H19敲除克隆悬滴法生成的EB不同天数形态，标 尺为200ym，图10A为悬滴法培养基为M15(DMEM+15%FBS);图10B为悬滴法培养基为 M15(K0-DMEM+15%FBS)。
[0036]图11为将二倍体的H19AESCs注射到二倍体囊胚中，产生的嵌合体小鼠。
[0037] 图12为H19敲除克隆的印记基因表达情况检测，0G-3细胞为对照。
[0038] 图13为H19敲除克隆的印记基因Snrpn/Gtl2甲基化状态分析。精子DNA为对照。 空心圆圈表示未甲基化的CpG位点，实心圆圈代表甲基化的CpG位点。
[0039] 图14A-图14H为利用H19A1细胞系产生ICAHCI可育小鼠。图14A.重构的囊胚 显示ahESCs来源的0ct4-EGFP绿色荧光。图14B-图14E.胎儿及成年的H19A半克隆小鼠 及其后代。图14F-图14H半克隆小鼠（图14F)及其所生后代（图14G和图14H)中H19 敲除情况的PCR鉴定。
[0040] 图15为1119&半克隆小鼠的印记状态分析。C57BL/6小鼠尾巴DNA为对照。空心 圆圈表示未甲基化的CpG位点，实心圆圈代表甲基化的CpG位点。
【具体实施方式】
[0041] 实验方法
[0042] 1?载体的制备
[0043] 1. 1质粒载体
[0044] 1. 1. 1感受态细胞的制备
[0045] (1)划线涂板：用灭菌的接种环蘸取少量E.coliDH5a菌液，在不含抗生素的LB 琼脂平板上划线，使菌液逐渐稀释。倒置放于37°C细菌培养箱，过夜培养12-14h。
[0046] (2)挑取单菌落，接种到5ml不含抗生素的LB培养基中。37°C，250rpm摇过夜。
[0047] (3)取2ml浑浊的菌液接种到200ml不含抗生素的LB培养基中，37 °C振荡培养 2-3h。每半小时测一次0D6。。，使其达到0. 4-0. 6。
[0048] (4)将该菌液冰浴20min。将冰浴后的菌液转移至预冷的50ml离心管中。4°C， 4000rpm，lOmin离心。
[0049] (5)弃上清。用20ml预冷的0? 1MCaCl2溶液重悬细菌沉淀。4°C，4000rpm，lOmin 离心。
[0050] (6)弃上清。按每50ml菌液加入2ml预冷的含20%无菌甘油的0?lMCaCU容液 重悬细胞沉淀。
[0051] (7)分装（50iil/管），快速放于液氮中冷冻，再放入-80°c保存。
[0052] 1. 1. 2质粒的快速热激活转化
[0053](1)将50y1E.coliDH5a感受态细胞放到冰上融化，加入l-l〇ng质粒，轻柔混 匀。
[0054] (2)将感受态细胞与质粒的混合液放到冰上，静置30min。
[0055](3)将上述混合液在42°C水浴中进行热激活（90s)，热激后迅速放到冰上，静置 2min〇
[0056] (4)取适量热激后的感受态细胞均匀涂到有抗生素的LB琼脂平板上。
[0057] (5)将LB平板倒置放于37°C细菌培养箱，培养12_16h。可以见到许多独立的细菌 菌落。
[0058] 1. 1. 3质粒的小提（使用QIAGEN质粒小提试剂盒）
[0059] (1)挑取转化后的单菌落，接种到3-5ml含有抗生素的LB培养基中，37°C剧烈振摇 下培养过夜。
[0060] (2) 12000rpm，lmin离心，收集细菌沉淀。加入 250y1Plbuffer(50mMTris.C1， 10mMEDTA，100μg/mlRNaseA)，振荡混匀。
[0061](3)加入 250y1P2buffer(200mMNaOH，1 %SDS)，轻柔颠倒混匀。
[0062](4)加入 35〇y1N：3buffer(3.OMNaAC，pH5. 5)，轻柔颠倒混匀。
[0063] (5) 13000rpm，lOmin离心。
[0064] (6)小心吸取上清，加到QIApr印离心柱中。12000rpm，lmin离心，弃废液。
[0065] (7)加入0.751111?￡1311打641.011似(：1，5011111?)?5，15%异丙醇）漂洗，12000邝111， lmin离心，弃废液。
[0066] (8) 12000rpm，2min离心，以去除残留的漂洗液。
[0067] (9)加入 50y1EBbuffer(10mMTris?Cl，pH8. 5)，室温放置lmin。12000rpm， lmin离心洗脱质粒。
[0068] 1. 1. 4质粒的中提或大提（使用QIAGEN质粒中提或大提试剂盒）
[0069] (1)挑取转化后的单菌落，接种到3_5ml含有抗生素的LB培养基中，37°C剧烈振摇 下培养8h。
[0070] (2)按1/500到1/1000的比例将菌液接种到含有抗生素的LB培养基中，37°C剧烈 振摇下培养12-16h。
[0071] (3) 4°C，6000g，15min离心，收集菌体。
[0072] (4)用 4ml(中提）或 10ml(大提）Plbuffer(50mMTrisxCl，10mMEDTA，100yg/ mlRNaseA)重悬细菌沉淀。
[0073] (5)加入 4ml(中提）或 10ml(大提）P2buffer(200mMNaOH，1%SDS)，轻柔混匀， 室温放置5min。
[0074](6)加入 4ml(中提）或 10ml(大提）预冷的P3buffer(3.OMNaAC，pH5. 5)，轻柔 混匀，冰上放置20min。
[0075] (7)4°C，20000g，30min离心。重复一次。
[0076] (8)将41111(中提）或1〇1111(大提）〇81'1311打61(75〇1111似(：1，5〇111丽0?5，15%异丙 醇，0? 15%TritonX-100)加到QIAGEN-tip进行柱平衡。
[0077] (9)将离心后的上清液加到平衡好的QIAGEN-tip柱子中。液体在重力的作用下流 出。
[0078] (10)用 10ml(中提）或 30ml(大提）QCbuffer(1.0MNaCl，50mMM0PS，15