Aqp5启动子荧光素酶报告基因的重组与药物筛选应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人水通道蛋白5 (AQP5)启动子荧光素酶 报告基因重组、构建AQP5启动子细胞模型，并用其筛选可能的药物单体。
【背景技术】
[0002] 舍格伦综合征（SS)是一种以侵犯涎腺、泪腺等外分泌腺为主的自身免疫性疾病。 患者常表现为口唇干裂、口腔黏膜溃疡、猖獗龋、真菌和病毒感染并伴有灼痛，有异物感等。 以上临床症状均是由于患者口内唾液量分泌减少所致。随着人们生活方式的变化，其发病 率越来越高。在成人发病率达0.5%-3.0%，且好发于中老年女性，男女比例为1:9。到目 前，尚无有效的治疗此疾病的药物，因此开发治疗舍格伦综合征的有效药物具有重要的现 实意义。
[0003] 近年来国内外研究显示水通道蛋白（aquaporins,AQPs)与舍格伦综合征的发病 密切相关，特别是水通道蛋白5(AQP5)是唾液分泌过程中的关键基因，它广泛表达于颂下 腺、舌下腺和腮腺中。高表达的AQP5与唾液的分泌量密切相关，这使其成为治疗舍格伦综 合征重要的分子靶点。
[0004]AQP5表达受启动子区域的调控。在此发明中，我们利用基因重组技术，采用PCR的 方法，从人类基因组中扩增出了 964bp的AQP5启动子序列，并将其克隆到荧光素酶报告基 因载体上。将荧光素酶报告基因的重组质粒转染到J1EK293T细胞中，成功构建了AQP5启动 子细胞模型，研究中药成分对AQP5启动子表达的影响，是筛选出治疗舍格伦综合征有效中 药成分的关键步骤。
[0005] 人参属药物是我国享有盛名的名贵天然药材，而人参皂苷Rbl是人参属药物中重 要的生物活性化合物。据报道Rbl可应用于癌症、心血管系统疾病、中枢神经系统等相关疾 病的治疗，并且对机体的免疫系统也具有一定的调节作用。本发明中，应用AQP5启动子细 胞模型筛选出人参皂苷Rbl成分能显著激活AQP5启动子的活性，且一定浓度的Rbl可上调 HSG细胞中AQP5蛋白的表达水平，为开发舍格伦综合征治疗药物提供实验依据。在动物药 效实验中我们发现，Rbl可促进涎腺唾液的分泌，增加SS疾病小鼠的饮水量，改善其颂下腺 炎性病变，并可通过上调颂下腺中AQP5蛋白的表达改善口干症状，为治疗舍格伦综合征药 物组分的研发开辟了新思路。
【发明内容】
[0006] 本发明是基于舍格伦综合征的典型临床表现和治疗难点，通过构建AQP5启动子 荧光素酶报告基因，构建AQP5启动子细胞模型，应用于药物筛选，对于开发治疗舍格伦综 合征的药物具有重要的应用价值。
[0007] 利用基因工程技术，通过NCBI数据库查找AQP5启动子序列，应用primerpremier 5. 0设计AQP5启动子的引物，以人类基因组为模板进行PCR。扩增得到的片段与pGEM-T Easy载体连接。经酶切鉴定并测序后，将片断亚克隆到pGL2载体上，构建pGL2-AQP5p重 组质粒。通过酶切鉴定和测序进行验证，实现了AQP5启动子-Luc表达载体的重组。随后 将重组质粒转染至HEK293T细胞中，用于中药的筛选。研究发现一定浓度的Rbl成分可使 AQP5启动子活性增高，增强AQP5蛋白的表达。
[0008] 这段启动子的氨基酸序列为：
[0009]
[0010] AQP5启动子重组质粒构建及药物筛选的过程包括以下步骤，【图1】：
[0011] 第一步：目的片段的获取
[0012] 应用primerpremier5. 0引物设计软件设计AQP5启动子的引物，以人类基因组 为模板，运用PCR技术，扩增得到目的片段。
[0013] 第二步：克隆载体的构建
[0014] 将扩增得到的目的片断与pGEM-T Easy载体连接，经转化、提取等步骤得到重组质 粒后，酶切鉴定并测序。
[0015] 第三步：表达载体pGL2-AQP5p的构建
[0016] 将克隆质粒和pGL-2载体进行双酶切后连接，经转化、培养和提取，构建 pGL2-AQP5p重组质粒，酶切鉴定重组体，并且测序进一步确定。
[0017] 第四步：药物筛选
[0018] 实验应用荧光素酶检测报告系统试剂盒研究Rbl对AQP5启动子活性的影响。以 转染效率较高的293T细胞为宿主细胞，在293T细胞中分别加入PBS和Rbl药物，每组设置3个平行孔。将加入PBS组为对照组，检测荧光值并计算平均值和标准差。
[0019] 第五步：细胞水平药效验证
[0020] 以Rbl药物刺激人唾液腺润管细胞（HSG)，利用westernblot检测药物对AQP5 蛋白表达的影响。
[0021] 第六步：动物水平药效验证
[0022] 用Rbl药物干预SS小鼠模型，观察并记录小鼠唾液量、饮水量的改变，测量小鼠颂 下腺指数，对小鼠颂下腺病理切片进行染色，观察其组织病变情况，特别是利用了免疫 组织化学染色的方法，检测药物对小鼠颂下腺内AQP5蛋白表达的影响。
[0023] AQP5启动子报告基因的成功构建和药物筛选的应用，证明了一定浓度的Rbl药物 激活AQP5启动子报告基因活性，并增强HSG细胞中AQP5的表达。通过动物实验，我们进一 步验证了Rbl对颂下腺组织AQP5的调节作用，发现Rbl上调了小鼠颂下腺中AQP5的表达 水平，促进腺体分泌唾液，减少饮水摄入，缓解腺体炎性症状，治疗了SS鼠的口干症状。临 床可应用此种药物治疗舍格伦综合征，为SS的药物研发提供了新思路，并展示了广阔的应 用前景。
【附图说明】：
[0024] 图1为实验流程示意图；
[0025] 图2为pGL2-AQP5p重组质粒的构建过程示意图；
[0026] 图3为PCR扩增出的AQP5基因的启动子片段凝胶电泳图；
[0027]图4为AQP5 (-852 ~+111)片段与pGEM-T Easy vector连接示意图；
[0028] 图5为pGEM-T_AQP5p重组质粒酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
[0029]图 6 为pGEM-T-AQP5p测序结果；
[0030] 图7为AQP5 (-852~+111)片段与pGL-2basic vector连接示意图；
[0031] 图8为酶切重组质粒pGL2-AQP5p的琼脂糖凝胶电泳图；
[0032] 图9为药物筛选双荧光素酶检测结果数据图表
[0033] 图10为Rbl对HSG细胞中AQP5蛋白表达的影响western blot扫描图
[0034] 图11为SS动物实验流程图
[0035] 图12为小鼠周饮水量示意图
[0036] 图13为小鼠唾液量不意图
[0037] 图14为小鼠颂下腺指数示意图
[0038] 图15为ConA刺激脾T细胞增殖能力的影响示意图
[0039] 图16为小鼠颂下腺HE染色结果图
[0040] 图17为小鼠颂下腺AQP5免疫组织化学染色结果图
【具体实施方式】：
[0041] 实施例一：pGL2-AQP5p重组质粒的构建【图2】
[0042] 1.目的片段的获取
[0043] 通过NCBI数据库查找AQP5启动子，应用primerpremier5. 0引物设计软件设计 AQP5启动子全长的引物。以人类基因组为模板，上游引物为
[0044] 5'GGTACCAAGACAGCAAAAGGCAGGAAGG(含Kpnl酶切位点），下游引物为
[0045] 5'CTCGAGGCATGATGCGCCCAGGTT(含HindllI酶切位点），进行PCR，成功扩增出 AQP5启动子目的片段，长度为964bp【图3】，应用AxyPr印PCR清洁试剂盒回收AQP5启动 子的DNA片段。
[0046] 2.pGEM-T-AQP5p重组质粒的构建
[0047] 将AQP5启动子片段与pGEM-TEasy载体连接，如【图4】所示。连接体系为 Solution〗连接酶 5ul，pGEM_TEasyVector0.5ul，纯化的DNA5ul，混合均勾，16°C连接 过夜。将连接产物全部加入l〇〇ul新鲜制备的感受态细胞中混匀，冰浴30min，放入已加温 至42°C的水浴中，热激90s(期间不要摇动试管），迅速放入冰浴中2min，加入600ulS0C培 养基，放入37°C摇床振荡lh，铺到含氨苄（Amp)抗性的平板上，37°C平放待液体吸干后，倒 置平皿继续培养12-16h，待出现乳白色菌落后挑克隆。以碱裂解法小提重组质粒后，分别以 EcoRI、KpnI和Hindlll进行单酶切鉴定，结果如【图5】所示，并进行测序进一步验证，结果 如【图6】所示。
[0048] 3.pGL2-AQP5p重组质粒的构建
[0049] 将pGL-2载体、pGEM-T-AQP5p重组质粒应用Kpnl和Hindlll共同进行双酶切。 酶切体系为lOXBuffer5ul，质粒2mg(根据大量提取质粒浓度计算体积），KpnI2ul，用水 补足到50ul，混匀后37°C酶切3h，取3ul鉴定，BSA5ul，Hindlll2ul，混匀后37°C酶切过 夜，电泳回收。如【图7】所示将上述回收AQP5启动子片段与pGL2载体连接，连接体系为 Solution〗连接酶 5ul，pGL2Vector0? 5ul，AQP5promoter5ul混合均勾，16°C连