Stch基因敲除动物模型的构建方法及应用

文档序号:9391916阅读:796来源:国知局
Stch基因敲除动物模型的构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因技术领域,尤其是涉及STCH基因敲除动物模型的构建方法及应 用。
【背景技术】
[0002] 热休克蛋白(Heatshockproteins,HSP)是机体在应激条件下迅速合成的一种蛋 白质,又被称为应激蛋白。该家族成员作为分子伴侣参与到生物体内蛋白质的折叠、组装和 转运等过程,但不参与最后蛋白的组装。热休克蛋白除了以非特异性分子伴侣发挥作用外, 也参与到细胞的保护系统。它们一方面通过快速清除细胞内失去功能的蛋白质来实现细胞 结构的稳定,还可以使细胞产生热耐受的能力。该蛋白家族种类很多,功能上也有细微的差 另IJ。科学工作者在蛋白分子量的基础上将热休克蛋白分为4个大家族:HSP90家族(分子 量主要在在83-90kDa)、HSP70家族(分子量主要在66-78kDa)、HSP60家族及小分子量热休 克蛋白家族。这四大家族中最保守的一类热休克蛋白是HSP70,它之所以成为现今研究的热 点是由于其广泛的生物学功能。
[0003] 应激与分子伴侣蛋白(Stressandchaperone,STCH)为热休克蛋白家族70的成 员之一。1994年STCH基因被科学家克隆出来并将其定位在人类染色体21qll.l。它编码 一个60kD大小的蛋白。目前证明STCH在内质网腔内(ER),但缺少一个一致性的羧基端的 驻留序列,这是该基因的亚细胞结构定位;应激与热休克蛋白的N末端含有特有的疏水如 导肽序列,该序列由22个氨基酸残基构成,但是与其他热休克蛋白不同的是它缺少羧基端 肽的结合域。这种独特的结构使它与其它Hsp70家族成员在氨基酸水平只具有33%的同源 性。同时与其它Hsp70家族所不同的是STCH对热刺激无应激反应,却被钙离子成功应激诱 导。而钙离子稳态破坏是引起神经退行性疾病的一个重要原因。因此,对该基因的研究可 以进一步深入探讨神经退行性疾病的发病机制,对寻找有效的治疗靶向有重要的作用。
[0004] 神经退行性疾病是一种慢性、多因素诱导的疾病。它以运动系统、感觉系统或 者认知系统中神经元的死亡及减少为典型特征,诸如帕金森病(Parkinsondisease,F>D)、 阿尔兹海默氏病(Alzheimersdisease,AD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis,ALS)、亨廷顿舞蹈症(Huntingtondisease,HD)、|j元病毒病(Priondisease)、聚 谷氨酰胺病(Polyglutaminedisease)等。这些疾病的主要形成原因是在遗传或者环境因 素的诱导下,使细胞内外的蛋白质出现错误折叠而异常聚集成团块样不溶结构,这些团块 样无功能的蛋白凝聚体并没有及时被机体的溶酶体系统、泛素-蛋白酶系统的蛋白清理系 统所及时降解,而使其产生对神经系统的危害作用。因此,上述的神经退行性疾病又被学者 们称为蛋白质错误折叠疾病。
[0005] 对于上述神经退行性疾病的研究以及相应药物的开发需要依赖有效的动物模型 的建立,并且有效的动物模型的建立有利于相关疾病的机制研究及药物筛选。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种STCH基因敲除 动物模型的构建方法及应用。
[0007] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0008] 本发明第一方面:提供一种STCH基因敲除动物模型的构建方法,STCH条件性基因 剔除小鼠是通过基因打靶的策略,在STCH基因外显子2两端插入方向相同的LoxP位点,当 该小鼠在导入Cre重组酶的情况下,Cre重组酶通过识别LoxP位点,切除LoxP位点间的序 列,达到在特定细胞中条件性剔除STCH基因的目的。
[0009] 具体包括以下步骤:
[0010] 1)在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养来源于129SV/J品系雄性小鼠的CJ7胚胎 干细胞,收集通过针对于STCH基因外显子2的打靶载体产生突变的STCH基因敲除的胚胎 干细胞,
[0011] 2)制备小鼠供体囊胚,
[0012] 3)将STCH基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚,
[0013] 4)将含有STCH敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫,
[0014] 5)该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠,
[0015] 6)获得进入种系的嵌合体小鼠,
[0016] 7)得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。
[0017] 所述的STCH基因与STCH基因外显子2的序列均可从基因库查询得到。
[0018] 优选地是,所述的动物为STCH基因杂合敲除小鼠。
[0019] 本发明第二方面:提供STCH基因敲除动物模型的应用。
[0020] 首先,STCH基因敲除动物模型作为抑郁和/或痴呆发病研究的动物模型。进行抑 郁和/或痴呆发病研究包括以下内容中的一种或几种:
[0021] (1)基因型鉴定:通过普通PCR技术对STCH基因敲除动物进行基因型鉴定,并在 蛋白水平采用Westernblot进行验证;
[0022] (2)行为学实验筛查:分别对不同年龄段的STCH基因敲除动物与对比动物进行转 棒行为学、悬尾行为学、强迫游泳行为学、旷场行为学及水迷宫行为学检测;
[0023] (3)在mRNA水平采用RT-PCR技术对不同年龄段STCH基因敲除动物与对比动物的 皮层进行抑郁相关基因BDNF、TPH2、FKBP5、GAD1、GAD2、HTR2a、Crebl的表达进行检测;
[0024] (4)在蛋白水平采用WesternBlot技术对STCH基因敲除动物与对比动物进行自 噬相关抗体、记忆相关抗体和抑郁相关抗体的检测;
[0025] (5)通过免疫荧光检测GFAP、⑶11b、STCH、F4/80在STCH基因敲除动物与对比动 物黑质脑区的表达;
[0026] (6)采用HPLC-MS技术从递质水平检测STCH基因敲除动物与对比动物整个脑组织 内多巴胺及其代谢产物二羟苯乙酸的含量。
[0027] 其次,STCH基因敲除动物模型用于抗抑郁和/或痴呆的药物筛选,此时其包括以 下步骤:
[0028] (1)给STCH基因敲除动物模型施用待筛选的测试药物;
[0029] (2)观察STCH基因敲除动物模型中的抑郁和/或痴呆的相关症状和/或指标,并 与对照组进行比较;
[0030] 其中,所述STCH基因敲除动物模型中抑郁和/或痴呆的相关症状有显著改善,则 表示该测试物是潜在的抗抑郁和/或痴呆的药物。
[0031] 本发明第三方面:提供STCH基因的应用,其用于制备预防和/或治疗抑郁和/或 痴呆的药物。
[0032] 所述的药物包括过表达STCH基因的药物。
[0033]与现有技术相比,本发明采用基因敲除技术制备STCH基因敲除动物模型,通过动 物行为学检测,该小鼠出现随着年龄增长抑郁症状(强迫游泳、悬尾实验)和记忆功能障碍 (水迷宫),具有抑郁症和痴呆的病理特征,可用于抗抑郁和痴呆药物的筛选。
【附图说明】
[0034] 图1为利用PCR扩增技术鉴定新生小鼠的基因型结果。
[0035] 图2为STCH+/-与STCH+/+小鼠STCH蛋白水平表达量分析,A图为western blot 实验结果;B图为蛋白定量结果。
[0036] 图3为不同年龄段STCH+/-小鼠与STCH+/+小鼠的转棒行为结果。横坐标lm表 示鼠龄一月,依此类推。纵坐标表示小鼠停留在转棒上的时间,单位为秒。
[0037] 图4为不同年龄段STCH+/-与STCH+/+小鼠的悬尾实验结果。横坐标lm表示鼠 龄为一月,其余依次类推。纵坐标表示小鼠头部向下非正常体位悬挂时停止挣扎的总静止 时间,单位为秒。
[0038] 图5为STCH+/-与STCH+/+小鼠强迫游泳行为实验结果。横坐标m表示月,其余 依次类推。纵坐标表示小鼠在水环境中时停止挣扎的总时间,单位为秒。
[0039] 图6为STCH+/-与STCH+/+小鼠旷场实验中穿越中间位置的频率结果图。
[0040] 图7为旷场实验中STCH+/-与STCH+/+小鼠的运动总距离结果示意图。
[0041] 图8为旷场实验中STCH+/-与STCH+/+小鼠在探索中平均速度结果示意图。
[0042] 图9为水迷宫行为学实验中STCH+/-及STCH+/+小鼠训练时的结果示意图。横坐 标dayl表示训练第一天,其余依次类推。纵坐标表示训练时小鼠从入水到找到平台的潜伏 期,单位秒。
[0043] 图10为水迷宫行为学实验中不同年龄段STCH+/-及STCH+/+小鼠测试时的结果 示意图。
[0044] 图11为六个月鼠龄的STCH+/-及STCH+/+小鼠的皮层部位抑郁及记忆相关基因 筛查结果。
[0045] 图12为六个月鼠龄两组小鼠皮层各个神经营养因子的表达结果。
[0046] 图13为六个月鼠龄两组小鼠整个半脑各个神经营养因子的表达结果。
[0047] 图14为六个月鼠龄两组小鼠黑质各个神经营养因子的表达结果。
[0048] 图15为SDS-PAGE凝胶电泳所使用的抗体列表。
[0049] 图16为STCH+/-与STCH+/+小鼠整个脑区内自噬相关蛋白的表达及定量。
[0050] 图17为STCH+/-与STCH+/+小鼠皮层内自噬相关蛋白的表达及定量。
[0051] 图18为STCH+/-与STCH+/+小鼠半脑脑区自噬相关的磷酸化蛋白的表达及定量。
[0052] 图19为STCH+/-与STCH+/+小鼠皮层自噬相关的磷酸化蛋白的表达及定量。
[0053] 图20为STCH+/-与STCH+/+小鼠半脑脑区记忆相关蛋白的表达及定量。
[0054] 图
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