使用微粒和独特探针组筛选结合相互作用的方法
【专利说明】使用微粒和独特探针组筛选结合相互作用的方法
[0001] 本申请是2008年5月1日提交的题为"使用微粒和独特探针组筛选结合相互作用 的方法"的国家申请号为200880022471. 5 (PCT/US2008/062194)的发明专利申请的分案申 请。
[0002] 本申请要求2007年5月3日提交的美国临时专利申请60/915, 920的优先权，该 专利申请的全文以引用方式并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及使用多组微粒筛选结合相互作用的方法，其中所述组具有相同的可鉴 别特征并且其中多组中的一组包括微粒亚群，所述亚群呈现至少一种独特的探针，该探针 用作生物样品中靶分子的结合对象（partner)。具体来说，本发明提供使用这些多组微粒检 测供体组织或受体组织中的组织分型抗原的方法。
[0004] 发明背景
[0005] -种此类组织分型抗原是人白细胞抗原（HLA)。个体可能在怀孕期间或通过输血 或之前的器官移植而对HLA抗原敏感。测定对HLA等位基因敏感性的测试涉及组织和器官 移植，其中受体中存在抗供体HLA抗原的抗体（供体特异性交叉配血（crossmatch))是高 风险移植排斥的前兆。在移植领域中标准的实施方式是测试抗一系列经选择代表人群的 HLA抗原的所有可能受体，并检测血清反应性的HLA等位基因的百分比。在这个系列反应性 抗体（PRA)中，患者血清抗正常人群中存在的高百分比HLA等位基因的测试反应是高风险 移植排斥的前兆。
[0006]HLA基因座本质上是高度多态的。如NomenclatureforFactorsoftheHLA System2000(Hum.Immunol. ;62(4) :419-68)，2001)中所公开，有 124 种HLA-A等位基因、 258种HLA-B等位基因、74种HLA-C等位基因、221种HLA-DRB1等位基因、19种DRB3等位 基因、89种DRB4等位基因、14种DRB5等位基因、19种DQA1等位基因和39种DQB1等位基 因，还不断发现新的等位基因。作为这种快速过程的证实，世界卫生组织HLA因子命名委员 会（WHOnomenclatureCommitteeforFactorsoftheHLASystem)(www.anthonynolan. com/HIG/) 2007年4月的修订本中显示有545种HLA-A等位基因、895种HLA-B等位基因、 307种HLA-C等位基因、8种HLA-E等位基因、12种HLA-H等位基因、9种HLA-J等位基因、 6种HLA-K等位基因、4种HLA-L等位基因、4种HLA-P等位基因、3种HLA-V等位基因、3种 DRA等位基因、494种DRB1等位基因、1种DRB2等位基因、44种DRB3等位基因、13种DRB4 等位基因、18种DRB5等位基因、3种DRB6等位基因、2种DRB7等位基因、10种DRB8等位基 因、1种DRB9等位基因、34种DQA1等位基因、83种DQB1等位基因、23种DPAU126种DPB1 等位基因、4种DMA等位基因、7种DMB等位基因、12种D0A等位基因和9种D0B等位基因。
[0007] 所有的HLA-A、-B和-C等位基因都具有类似的序列。对于DRB1、DRB3、DRB4和 DRB5序列情况也相同。由于这些相似性，极为通常的情况是当引物对用于实施聚合酶链式 反应序列特异性引物（PCRSSP)时，将扩增两种或更多种等位基因，或者在诊断性序列特异 性寡核苷酸探针检测（SS0)体系中，两种或多种等位基因将杂交。因此，对于各个等位基 因，要具有独特的PCR-SSP或检测-SSO模式，必须使用许多对引物或探针。此外，在HLA分 型中诊断杂交SS0探针的使用会被HLA等位基因所具有的高水平的同源性所混淆。因此， 许多现有的分型方法（如Bugawan等人，TissueAntigens44 :137-147 (1994)中的那些） 缺乏HLA分型和其他应用所需的准确度。
[0008] 可以使用PCR来鉴定靶DNA模板上的序列。如果发生了扩增，则模板DNA含有与所 使用的引物相同的序列。如果扩增没有发生，则模板DNA上的序列与引物序列不同。Newton 等人，美国专利5, 595, 890公开了用于分型的PCR诊断方法，包括使用PCR-SSP的HLA的分 子分型。根据这种方法，以多循环PCR的阳性或阴性反应模式为基础来分配未知的等位基 因。然而，Newton所公开的方法对于HLA分型的效力有限，这是由于如上所述的HLA中的高 度多态性所致。结果，各自具有特定序列的两个引物频繁扩增很多HLA等位基因，从而增加 所需的PCR扩增数以分配未知的等位基因。由于类似的原因，在非PCR方法中正确的HLA分 型需要多种诊断探针。PCR需要一对引物与DNA模板上要扩增的区域侧面相接。引物退火 至所需序列的能力取决于引物的长度和PCR热循环程序中所设置的退火温度。引物越长， 则需要越高的退火温度来达到DNA序列的特异性扩增。PCR-SSP使用引物长度和退火温度 之间的平衡来达成引物指导的序列扩增的特异性。
[0009] 在用于HLA分型的PCR-SSP系统的临床应用中，需要使用有限数目的PCR反应来 达成尽可能高的分辨率，从而降低引物对所扩增的等位基因数（即，增加引物或探针的特 异性）。本发明所关注的是共同拥有的美国专利6, 207, 379的公开内容（其公开内容以引 用方式并入本文），它教导了诊断PCR引物的用途，其特征在于不连续（缺口）序列用于在 HLA分型中获得相关等位基因之间的更大差异。在另一实施方式中，U. S. 6, 207, 379教导了 与靶核酸中的不连续序列杂交并通过聚合酶介导的引物延伸扩增该靶的诊断引物用途。尽 管U. S. 6, 207, 379方法成功地进行了靶HLA序列更特异地扩增，但仍然需要改良的方法来 检测PCR和非PCR方法中的HLA序列。
[0010] U.S. 6, 207, 379中所述的PCR发明解决了本领域内的下列需要：改良 PCR-SSP-基分子分型方法，从而可增加分型的特异性以便减少每次分型所需要的PCR反 应数。然而，本领域内还需要在非PCR方法中探测特定序列的方法。由于基本的热力学原 因，探针和模板（包括完全配对的那些）处于杂交和非杂交状态之间的平衡状态中。探针 在一个时刻与其靶模板相连，在另一时刻可能不相连。PCR中的聚合酶通过延长（引物延 伸）将引物锁定在适当位置而发挥关键的作用。在非PCR方法中，缺乏关键的因子-聚合 酶（和随后的延长），并不必须预期得到靶标短探针的长期稳定的杂交双链。由于这些原 因，通常认为杂交探针需要比相应的延伸引物更长以便确保稳定的双链形成。
[0011] 以引用方式全文并入本文的美国专利公布US2003-0165925A1提供了检测HLA 核酸和T细胞受体核酸序列的改良方法，从而增加了诊断探针的特异性。这些方法中特异 性增加是因为至少一种探针能够识别靶标的两个或更多个区域并且这能够在不增加靶核 酸序列的探针的退火温度的条件下如此进行。探针组的特异性增加降低了所检测的等位基 因数目，从而增加了该方法的分辨率，并且在较低的成本下达成。
[0012] 目前，基于DNA的（DNA-based)组织分型方法是昂贵且耗时的，因为这些方法需要 检测许多不同的标签以区分不同的SS0探针，如通过流式细胞术或来自照相机或显微镜的 目视图像，如生物阵列（Bioarray)。尽管理论上可以制备无限数目的代表不同寡核苷酸探 针的独特标记微粒，但是在使用诸如荧光标记的流式细胞术等单个分析期间可以区分和测 量的标签数在实际上是有限的。因此，本领域内需要可以在单个分析中使用有限数目的独 特标记微粒检测最大量的寡核苷酸探针。
【发明内容】
[0013] 本发明提供从有限的微粒组中获得更多数据的方法。当前可用的微粒组具有有限 数目的可鉴别特征（如，荧光标签）。使用常规方法一次可以检测的特征数有限。然而，需 要筛选的测试分子数则在持续增加。例如，对于基于DNA的组织分型，HLA抗原数目和多态 性在日益增加，供体样品的完整HLA筛选需要数百种探针。使用常规方法，完整的初步HLA 筛选需要多个分析。本发明的改良方法使得能够使用较少的不同标记的微粒来筛选更多的 靶分子，从而测量较少的特征，最终进行较少的分析运行。
[0014] 本发明的改良方法采用各自具有不同的可鉴别特征的多组微粒。本发明的改良 涉及使微粒组上呈现具有相同可鉴别特征的一种或多种不同探针，如各自经相同的荧光标 签包埋的一组微粒。因此，该分析可以在检测相同或更少的可鉴别特征时筛选更多的靶分 子。例如，可以使用100种不同标记的微粒来筛选多于100种的靶分子；或者，可以使用少 于100种的不同标签来筛选100种靶分子。
[0015] 本发明方法的探针充当生物样品内靶分子的结合对象。探针可以是任何结合对 象，包括核酸，如寡核苷酸、引物或与靶分子核酸互补的任何核酸。结合对象还可以是与靶 分子抗体结合的抗原，如肽抗原或蛋白；或与肽抗原或蛋白靶分子结合的抗体。此外，所述 结合对象可以是结合靶分子蛋白的任何蛋白，如受体和配体或复合的蛋白。结合相互作用 是任何蛋白结合对象之间的结合事件或核酸与SS0探针或引物或任何其他互补核酸的杂 交。
[0016] 这些方法优选使用呈现探针的微粒进行，所述探针与生物样品内的靶分子结合， 这种结合相互作用会产生可检测的信号。根据本发明的优选方面，所述探针可以是与DNA 样品杂交（结合）的序列特异性寡核苷酸（SS0)探针。或者，所述探针可以是与生物样品 中的抗体或另一种蛋白结合的肽、抗体或蛋白抗原。
[0017] 本发明的靶分子可以是生物样品中所关注的任何分子。本发明的方法是筛选靶分 子。在一个实施方式中，本发明的方法用于筛选组织分型等位基因。此方法可以使用任何 组织分型等位基因进行。整个说明书都描述HLA组织分型等位基因，但这些方法可以使用 任何组织分型抗原进行。
[0018] 本发明提供使用与具有独特可鉴别特征的微粒（如微球或珠子）结合的探针进行 组织分型的改良方法。本发明的方法用有限数目的可检测标记的且不同的可鉴别微粒组产 生更多的组织分型信息，这通过使用一组或多组具有相同可检测标签的微粒达成，但是其 中相同标记的微粒组包括具有不同探针的多个微粒亚组。
[0019] 例如，一组可以包括均用相同的荧光染料标记的10个微粒亚组，其中所述微粒亚 组具有不同的探针固定到其表面。使用这种方法，可以使用有限数目的不同标记的微粒筛 选更多种不同的组织分型抗原。
[0020] 在一个示例性实施方式中，本发明的改良方法可以通过将1000种不同的探针固 定在大量珠子（微粒）上而筛选1000种不同的组织分型。所标记的珠子被分为100组以 便各组由具有10种独特探针但用相同的荧光染料或荧光染料的独特组合标记的10个亚组 珠子构成。因此，许多相同标记的珠子（发射相同信号）将呈现不同的探针。因此，在示例 性筛选中，检测了 100种不同的荧光信号或信号的组合，但检测了 1000种不同的探针。
[0021] 相反，可以使用许多较少的独特标记来筛选相同数目的靶分子。因此，此方法使得 能够筛选许多组织分型抗原等位基因而仅使用更有限数目的标记珠子。此外，本发明的改 良方法更有效且需要较少的人力。改良方法需要较少的人力是因为对较高分辨率测试之前 进行低分辨率测试的需求较低。