对克雷伯菌k44，k59，k61和k63特异的核苷酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对克雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型特异的核苷酸，尤其涉及对克 雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型K抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 克雷伯氏菌为肠杆菌科中一类有荚膜的革兰氏阴性杆菌，在人类呼吸道、肠道、动 物肠道中最为常见。常常引起人类的多种疾病，尤其是肺炎克雷伯氏菌；也是自然界水和土 壤中的机会致病菌。其中肺炎克雷伯氏菌（又称肺炎杆菌）、臭鼻克雷伯氏菌和鼻硬结克雷 伯氏菌与人类关系最为密切，尤其是肺炎克雷伯氏菌，它们所导致的疾病占所有克雷伯氏 菌属感染的95%以上。
[0003] 细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然 而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这 种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和 储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不 同的K抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清 鉴定方法成为发展方向。
[0004] 克雷伯氏菌的表面抗原，既有0抗原也有K抗原，但是主要用K抗原进行分型，并 且K抗原研究的比较透彻。在克雷伯氏菌所有K抗原中，共描述了82种，但是只有77种组 成了国际上识别荚膜抗原机制的基础。尽管克雷伯氏菌也有12种0抗原，但是因为耐热的 荚膜多糖的存在，很难测定它们的结构并加以区分。相反，K抗原产量高，并且可以区分大 部分的临床分离菌株。由于高度的可区分性以及重复性，这种分类方法一直是研究菌株间 流行病学关系的首选方法，并且在比对来自不同地方不同时间的菌株方面尤为有用。对于 其分子鉴定也越来越受到人们的重视，分子生物学检测技术具有速度快且易于大规模使用 的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展方向。
[0005] 近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转 录间隔区（ITS)序列分析、随机扩增长度多态性（RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度 多态性（RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于克雷伯菌的快速血清分型筛查，稳定的 鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式 反应（PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵 敏、特异性强等优点。
[0006] 聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction,简称PCR技术）作为微生物 检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异 性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备 细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中 是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部 门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供了本发明涉及对克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特异 的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有： 1)SEQIDN0:1-8所示的核苷酸中的至少一种； 2) 与SEQIDN0:1-8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种；所述的SEQIDN0:1-8 如下：
本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDN0:1-4所示的核苷酸中的至少一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10 mMdNTP30y1 ; 10X酶特异性反应缓冲液50y1 ;5U/y1耐热DNA聚合酶5y1 ;引物混合 物10y1 ;阳性对照品10y1;阴性对照品10y1 ;ddH2〇 5ml。
[0008] 其中所述的PCR引物优选为所述如SEQIDNO: 1-14所示的核苷酸中的至少一种。
[0009] 本发明进一步公开了对克雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型特异的SEQID NO: 1-14核苷酸在制备用于检测克雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型的PCR试剂盒。
[0010] 本发明所述克雷伯菌指的是取样于腹泻大便、尿道感染、伤口和脑膜炎标本培养 物的粗提液或是克雷伯菌的纯培养物的粗提液。收集克雷伯菌提取基因组是采用常规方法 制备获得。
[0011] 针对克雷伯菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理一扩增一电泳检测结 果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样 本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。
[0012] 本发明还提供一种液相检测芯片，包括液相磁珠和连接在液相磁珠上的寡核苷酸 探针，以及相应探针所在片段所对应的相应引物；其中所述核苷酸优选为如SEQIDN0:1-8 所示的核苷酸。
[0013] 本发明还提供一种微列阵，其包括上述的核苷酸；其中所述核苷酸优选为如SEQ IDN0:1-8所示的核苷酸。
[0014] 本发明进一步公开了对克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特异的核苷酸在制备 用于检测克雷伯菌PCR试剂盒、检测克雷伯菌的基因芯片方面、检测克雷伯菌微阵列方面 的应用。所述的检测克雷伯菌指的是检测引起支气管炎、重症肺炎、泌尿系和创伤感染、败 血症、脑膜炎、腹膜炎的细菌。
[0015] 本发明公开的对克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特异的核苷酸与现有技术相 比，本发明具有如下优点： (1)实用性强 本发明建立的一种PCR反应体系，可检测克雷伯菌，提供血清分型检测所用到的特异 引物，利用该PCR方法可以对临床标本进行检测。
[0016] (2)准确性高 本发明通过对克雷伯菌的各血清型特异的基因的PCR反应，每个样品得到一条目的条 带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可以得到克雷伯菌所属的血清型。
[0017] (3)检测成本相对较低 可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、尚品监测检验检疫等领域，并为其他不同致 病菌检测组合提供技术模式。
[0018]
【附图说明】： 图1表示本发明K44血清型特异引物检测克雷伯菌其他血清型标准菌株电泳结果图，rzj基因P1和P2目的条带为180bp，其余的血清型没有任何条带，具体菌株信息见表2; 图2表示本发明K44血清型特异引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检测了 6株弧 菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图3表示本发明K59血清型wzy基因P3和P4引物检测克雷伯菌其他血清型标准菌 株电泳结果图，wzy基因P4和P5筛选，目的条带为140bp，其余血清型没有任何条带，具体 菌株信息见表2 ; 图4表示本发K59血清型wzy基因P3和P4引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中检 测了 6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表； 图5表示本发K61血清型r幻基因P5和P6引物检测克雷伯菌其他血清型标准菌株电 泳结果图，r幻基因P5和P6引物的筛选，目的条带为156bp，其余的血清型没有任何条带， 具体菌株信息见表2 ; 图6表示本发明K61血清型r幻基因P5和P6引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中 检测了 6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带，具体菌株信息见表2 ; 图7表示本发明K63血清型r幻基因P7和P8引物检测克雷伯菌其他血清型标准菌株 电泳结果图，目的条带为191bp，其余的血清型没有任何条带；具体菌株信息见表2 图8表示本发明K63血清型r幻基因P7和P8引物种特异性的鉴定电泳结果图，其中 检测了 6株弧菌以及1株沙门菌、1株大肠杆菌，均无任何条带；具体菌株信息见表2。
[0019] 图9表示分别用K44,K59,K61和K63特异引物扩增对应血清型的电泳结果图，具 体菌株信息见表2 ; 其中：K44,K59,K61和K63表示相应血清型引物扩增结果，第一个泳道H是2000bp laddermarker〇
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件。其中克雷伯菌来源于澳大利亚是有澳大利亚悉尼大学Peter 教授提供。
[0021] 实施例1:基_组的提取 37°C营养肉汤培养基培养克雷伯菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下： 用 500ul50mMTris-HCl(pH8. 0)和 10ul0. 4MEDTA重悬细胞，37°C温育 20 分钟，然 后加入10ul10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS，50°C温育2小时，再加入3ul10mg/ml的RNase，65°C温育30分钟。加等体积酚 抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 :24 :1)溶液抽提两次，取上清 液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷 出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ulTE中。基因组DNA通过0. 4%的琼脂 糖凝胶电泳检测。
[0022] 实施例2:序列破译 提取克雷伯菌K44,K59,K61和K63血清型标准菌株的基因组，通过Solexapair-end测 序技术对克雷伯菌各个血清型基因组进行全基因组测序获得该血清型的序列，运用Blast 及PSI-Blast进行序列比对，采用TMHMM2. 0program进行跨膜结构预测，运用ClustalW program进行序列对齐及筛选保守和特定基因片段，最终获得克雷伯菌各个血清型的K抗 原基因簇序列及破译结果。
[0023] 实施例3:引物设计 根据基因簇破译情况，我们发现wzy和wzx基因确实是血清型特异的基因，所以选取该 基因特异区段设计特异引物。由于wzy更加特异，所以主要以wzy基因为靶基因。
[0024] 引物设计是该发明的核心部分。设计引物根据文献中叙述的特异基因来设计。w