一种基于crispr的大肠杆菌o157:h7菌株检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于CRISPR的大肠杆菌0157:H7菌株检测试剂盒，同时本发明还 涉及一种基于CRISPR的大肠杆菌0157:H7菌株检测方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌0157:H7是大肠杆菌的一个主要致病菌株，0157:H7感染不仅可引 起出血性结肠炎、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症（PaiCH，Gordon R，SimsHV,etal.SporadicCasesofHemorrhagicColitisAssociatedwith EscherichiaColi0157:H7.Clinical,Epidemiologic,andBacteriologicFeatures[J]. AnnalsofInternalMedicine，1984, 101 (6) : 738-742)，而且在儿童和老年人群中还 可引起溶血性尿路综合症（hemolyticuremicsyndrome，HUS)和血栓性血小板紫癜 (thromboticthrombocytopenicpurpura，TTP)等全身性并发症，严重者肾衰竭导致死亡 (MoriY,ffadaH，TamakiS，etal.OutcomeofThromboticThrombocytopenicPurpura andHemolyticUremicSyndromeinJapan[J].ClinicalandAppliedThrombosis/ hemostasis:OfficialJournaloftheInternationalAcademyofClinicaland AppliedThrombosis/hemostasis，2000, 5 (2) : 110-112)D 目前，大肠杆菌 0157 :H7 检测 方法主要有常规检测法、免疫学检测法和分子生物学检测法。常规监测法的成本较高， 而分子生物学检测法简便、快速，常以特异性的编码基因如rfbE基因、鞭毛抗原H7特异 基因flic、stx(志贺样毒素）、hly(溶血素）、eaeA(编码粘附素）等作为靶基因（Pina M.FRATAMIC0,ChitritaDEBR0Y.DetectionofEscherichiaColi0157:H7inFoodUsing Real-timeMultiplexPerAssaysTargetingtheStx1，Stx2,ffzy0157,andtheFlic H70rEaeGenes[J].FoodAnalyticalMethods，2010, 3 (4): 330-337)，具有特异性强、操作 简便、结果准确等优点，是检测大肠杆菌〇157:H7的常用方法。
[0003] 成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clusteredregularlyinterspaced shortpalindromicrepeats，CRISPR)是由一段不连续的正向重复序列（direct repeat，DR)和插入其中的间隔序列（spacer，S)组成（TouchonMARIE，RochaEduardo PC.TheSmall,SlowandSpecializedCrisprandAnti-crisprofEscherichia andSalmonella[J].Pl0S0ne，2010,5(6):elll26)。CRISPR首先在大肠杆菌中 发现(IshinoY,ShinagawaH,MakinoK，etal.NucleotideSequenceofthelap Gene,ResponsibleforAlkalinePhosphataseIsozymeConversioninEscherichia Coli,andIdentificationoftheGeneProduct[J].JournalofBacteriolo gy，1987，169(12):5429-5433)。目前在许多细菌和古细菌中均有发现（GuoXJ，Wang YF，DuanGC，etal.DetectionandAnalysisofCrisprsofShigella[J] ?Current Microbiology, 2015, 70(1) :85-90；HorvathPHILIPPE,RomeroDennisA,Coulc-Monvoisin ANNE-CLAIRE，etal.Diversity,Activity,andEvolutionofCrisprLociin StreptococcusThermophilus[J].JournalofBacteriology, 2007, 190(4):1401-1412)。 重复序列在一个CRISPR位点中几乎完全一致，序列相对保守，其显著的特征是可以转录 且形成RNA二级结构，其体现细菌在进化中的保守性（MakarovaKiraS,HaftDaniel H,BarrangouR0D0LPHE,etal.EvolutionandClassificationoftheCrispr-cas Systems[J] ?NatureReviews.Microbiology, 2011, 9 (6) : 467-477)。间隔序列在CRISPR 结构中是高度可变的，在同一个CRISPR位点中几乎找不到两个相同的间隔序列。目前 普遍认为间隔序列来源于外源可移动遗传因子，如质粒、菌体等（MojicaFranciscoJ M,Dicz-ViHasefiorCeSAR,Garcla-MartlnezJESuS,etal.InterveningSequencesof RegularlySpacedProkaryoticRepeatsDeriveFromForeignGeneticElements[J]. JournalofMolecularEvolution, 2005, 60 (2) : 174-182)。大肠杆菌中已经描述有 4个CRISPR位点，CRISPR1和CRISPR2广泛存在于大肠杆菌中，具有一致的重复序列， 其分别位于核心基因iaP和cysH，ygcE和ygcF之间，CRISPR3和CRISPR4同样具有 一致的重复序列，其位于核心基因clpA和infA之间（Diez-VillasenorC,Almendros C,Garcia-MartinezJ,etal.DiversityofCRISPRlociinEscherichiacoli[J]. Microbiology,2010，156(Pt5): 1351-1361)。目前CRISPR在大肠杆菌中的研究主要 集中在大肠杆菌CRISPR的功能活性研究（PulUMIT，WurmREINHILD,ArslanZIHNI，et al.IdentificationandCharacterizationofE.ColiCrispr-casPromotersand TheirSilencingByH-NS[J].MolecularMicrobiology, 2010, 75(6):1495-1512；Pougach KSENIA,SemenovaEKATERINA,BogdanovaEKATERINA,etal.Transcription,Processing andFunctionofCrisprCassettesinEscherichiaColi[J].MolecularMicrob iology, 2010, 77 (6) : 1367-1379)，大肠杆菌CRISPR与耐药质粒转移的关系（Touchon M,CharpentierS,PognardD,PicardB,ArletG,RochaEP,etal.Antibioticresistance plasmidsspreadamongnaturalisolatesofEscherichiacoliinspiteofCRISPR elements.Microbiology, 2012, 158:2997-3004)等。而此前报道的基于CRISPR的定 量PCR特异性检测大肠杆菌0157:H7等相关血清菌株（Useofclusteredregularly interspacedshortpalindromicrepeatsequencepolymorphismsforspecific detectionofenterohemorrhagicEscherichiacolistrainsofserotypes026:HI1, 0 45 :H2, 0103 :H2, 0111 :H8, 0121 :H19, 0145 :H28,and0157:H7byreal-timePCR)的方法，需 设计三对引物和探针，检测步骤复杂，且成本较高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于CRISPR的大肠杆菌0157:H7菌株检测试剂盒。
[0005] 同时，本发明还提供一种基于CRISPR的大肠杆菌0157:H7菌株检测方法，该方法 操作简单，敏感性和特异性高，与大肠杆菌〇157:H7血清分型结果一致，并且检测费用低。
[0006] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0007] 基于CRISPR的大肠杆菌0157:H7菌株检测试剂盒，其包含针对大肠杆菌0157:H7 菌株的CRISPR1位点基因序列或其同源性达95%以上的同源序列设计的引物；
[0008] 所述引物如下所示：
[0009]上游引物：5'-GTTATGCGGATAATGCTACC-3'（如SEQIDNO. 1 所示），
[0010]下游引物：5' -CGTAYYCCGGTRGATTTGGA-3'（如SEQIDNO. 2 所示），Y为C或T，R 为A或G。
[0011] 具体的，下游引物中Y为T，R为G。<