一种检测vhl基因大片段缺失的杂交探针及检测方法与试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种用于检测VHL基因大片段缺失的杂交探 针及检测方法与试剂盒。
【背景技术】
[0002] VHL基因（M頂编号608537)定位于3p25-26,全长10KD，包含三个外显子和两个内 含子，可转录形成两种mRNA。包含三个外显子转录产物的mRNA翻译出p30 (213个氨基酸） 和pl9 (159个氨基酸）蛋白。pl9是VHL基因第二转录起始位点（54号密码子）转录形成 的异构体，与p30功能相似。
[0003]VHL基因突变方式多样，包括点突变、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位点突 变等。目前检测VHL基因突变最常用的方法是PCR直接测序，确诊率为38 %~80 %，但PCR 测序检测技术只能检测点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变，不能检测VHL基因大片 段缺失。
[0004] 近年来，国内外用于VHL基因大片段缺失检测的方法包括SoythernBlot、MLPA、 RT-PCR及MPQFM-PCR等。SouthernBlot和MLPA具有检测方法操作繁琐，价格昂贵，不 适于临床推广应用的缺陷。RT-pcr、mpqfm-pcr虽操作简单，但诊断效率却有限。而荧光 原位杂交在诊断基因大片段缺失上，兼有诊断效率高且适合临床推广的特点，因此，我们可 利用荧光原位杂交来诊断VHL基因大片段缺失，解决现有VHL基因大片段缺失检测效率有 限和推广困难的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供了可用于VHL基因大 片段缺失检测的杂交探针、检测试剂盒和检测方法。
[0006] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种用于快速检测VHL基因大片段缺失 的杂交探针，其上标有荧光信号，由具有SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的探针引物进行 PCR制备得到。
[0007] 其中，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR制备得 到的杂交探针的大小为300-1000bp。
[0008] 进一步优选地，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR 制备得到的杂交探针的大小为300-800bp。
[0009] 进一步优选地，所述由具有SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的探针引物进行PCR 制备得到的杂交探针的大小为300-500bp。
[0010] 为实现本发明的目的，本发明再一方面提供一种应用如SEQIDNO. 1~6所示的 碱基序列的杂交探针引物合成的杂交探针检测VHL基因大片段缺失的方法，包括：利用已 采集的待测样本制备细胞涂片；将所述杂交探针置于杂交液中与所述细胞发生杂交反应， 获得杂交产物；洗涤所述杂交产物，并进行细胞核染色处理，获得核染色后的细胞涂片；通 过荧光显微镜观察所述核染色后的细胞涂片，判断待测样本的DNA是否发生了VHL基因大 片段缺失。
[0011] 其中，所述待测样本是具有细胞核的细胞，可以是外周血、组织标本、尿液、脊髓及 其他含有VHL基因的具有细胞核的样本。
[0012] 其中，所述荧光原位杂交探针的浓度是约8-20ng/y1。
[0013] 优选的，所述荧光原位杂交探针的浓度是约10_15ng/y1。
[0014] 其中，所述杂交反应的共变性温度是70-80°C，共变性反应时间是5-10min。
[0015] 优选地，所述杂交反应的共变性温度是73-76°C，共变性反应时间是7-8min。
[0016] 其中，所述杂交反应的杂交温度是40-46°C，杂交时间是14-18h。
[0017] 进一步优选地，所述杂交反应的杂交温度是42-44°C，杂交时间是16h。
[0018] 其中，所述应用如SEQIDNO. 1~6所示的碱基序列的杂交探针引物对1-3检测 VHL基因大片段缺失的方法还包括制备荧光原位杂交探针。
[0019] 其中，所述制备荧光原位杂交探针包括：在人类基因组中筛选用作FISH探针的 VHL基因序列，通过克隆引物对4-6获得目的基因片段；将得到的基因片段连接到质粒中， 获得含有目的基因片段的质粒；将所述质粒在大肠杆菌中进行扩增，提取质粒后，得到质粒 溶液；利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧光原位杂交探 针。
[0020] 其中，所述制备细胞涂片过程包括：分离待测样本中的细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤 和KC1低渗处理后，用固定液固定所述细胞的形态，制成细胞涂片；将所述细胞涂片进行老 化处理，经胃蛋白酶消化处理后，进行酒精梯度脱水，得到细胞涂片。
[0021] 其中，所述克隆引物对4-6如SEQIDN0. 7-12所示的碱基序列，包括：
[0022] 克隆引物对 4F:f5'-aaccttagaggggcgaaaaa
[0023]R:5'-gcttcagaccgtgctatcgt
[0024]克隆引物对 5F:5'-aacctttgcttgtcccgata
[0025]R:5' -ttatcagagtgggtggcaca
[0026]克隆引物对 6F: 5'-gcaaagcctcttgttcgttc
[0027]R:5, -cagtcttcccaaagcaggag〇
[0028] 其中，所述通过克隆引物对4-6获得目的基因片段的反应体系是
[0029] 反应物 体积 PC'Rmix 25(.ii DNA模板 lOOng 引物 扣1 ddH：0 ^i|i： 总体积
[0030] 其中，反应体系中所述的引物包括克隆引物4、克隆引物5、克隆引物6。
[0031] 其中，所述通过克隆引物对4-6获得目的基因片段反应条件是：94°C预变性 lOmin，94°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 60s，30 个循环，72°C复性 7min，4°C保存。
[0032] 其中，所述将得到的基因片段连接到质粒中的反应体系是：T-vector0.7y1，PCR 产物5y1，T4连接酶1y1，T4Byffer1y1，ddH20余量，总体积10y1。其中，所述将得到 的基因片段连接到质粒中的反应条件是：在室温条件下反应2h。
[0033] 其中，所述探针引物对1-3如SEQIDNO. 1-6所示的碱基序列，包括：
[0034]探针引物 1 5'-agtaacgagttggcctagcctcg
[0035] 5?-cgtcttcttcagggccgtactc
[0036] 探针引物 2f5'-gtactgacgttttactttttaaaaagataagg
[0037] 5?-catgctctacacattgttctcctgg
[0038]探针引物 3 5'-gcattgcacatcaacggat
[0039] 5' -cagtcttcccaaagcaggag
[0040] 其中，所述利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧 光原位杂交探针的反应体系为：
[0041] 反应物 体积： X〇*PCRBluffer ：5：^1 2.5mMdATP 5am 2.5niMdCTP 5mii 2,5mMdGTPSnm 2.5mMdTTP 2.Snm Fluorescein-dUTP 2.5nm 貭粒 Ifll 引物 2(il Taq'酶 0.5卜d ddH20 余量 总休积 50(4
[0042] 其中，所述利用探针引物、荧光原料和所述质粒溶液制备具有荧光染料标记的荧 光原位杂交探针的反应条件为：94°(：预变性21^11，94°(：变性3〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸 458,30个循环，72°(：复性1〇111111，4°(：保存。
[0043] 其中，所述固定液是由体积比为3:1的甲醇和冰醋酸配制而成。
[0044] 其中，所述杂交液是是由体积比为5:1:1:3的甲酰胺、20xSSC、硫酸葡聚糖和水配 制而成。
[0045] 其中，所述老化处理是将所述细胞涂片在56°C条件下在烤片机上处理20min。
[0046] 其中，所述老化处理还可以是在15_30°C的室温条件下过夜放置12_16h。
[0047] 为实现本发明的目的，本发明再一方面提供一种用于检测VHL基因大片段缺失的 试剂盒，包括具有如SEQIDNO. 1-6所示的碱基序列的杂交探针引物制备得到的杂交探针， 还包括：用于将待测样本制备成细胞涂片的试剂I;用于使所述荧光原位杂交探针与所述 细胞发生杂交反应，获得杂交产物的试剂II;用于洗涤所述杂交产物，并进行细胞核染色 处理，获得核染色的细胞涂片的试剂III。
[0048] 其中，所述将待测样本制备细胞涂片的试剂I包括：由体积比为3:1的甲醇和冰醋 酸配制而成的固定液。
[0049]