融合免疫调节蛋白及其制备方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求在2013年3月12日提交的美国临时专利申请61/777016的优先权， 出于所有目的将所述申请的内容在此通过引用并入本文中。
[0003] 发明背景
技术领域
[0004] 本发明大体涉及生产用于癌症治疗的重组嵌合融合蛋白的领域，更具体地涉及 抗-EGFR1-TGFPRII、抗-EGFR1-PD1和抗-CTLA4-PD1的融合分子其生产方法，其中所述方 法削减了生产成本并增加了重组嵌合融合蛋白的同源性。
【背景技术】
[0005] 尽管医药研究有许多进展，但是癌症仍是美国死亡的第二主要原因。临床护理的 传统模式如手术切除、放射疗法和化学疗法具有显著的失效率，尤其对于实体肿瘤。因为原 发肿瘤不响应或因为在起始部位处的再生或转移导致的复发而发生失效。癌症仍是医药研 究和开发的中心焦点。
[0006] 对癌症的免疫疗法已经探索了 一个世纪，但是仅仅是在过去十年才将各种抗体基 产品引入患有不同形式癌症的患者的管理中。目前，这是临床研究的最活跃领域之一，有许 多抗体治疗产品已经被批准用于肿瘤学。
[0007] 使用特定抗体作为治疗剂提供了相对于非靶向疗法的优点，所述非靶向疗法例如 为通过药物的口服或静脉内施用的全身化学疗法或放射疗法。存在两种类型的抗体基疗 法。更常用的类型是识别肿瘤抗原（即在肿瘤和癌细胞上表达且不在正常组织中表达的蛋 白）和开发抗体，优选针对肿瘤抗原的单克隆抗体。人们便可以将任何治疗剂如化疗剂、放 射性核素、改性毒素等结合至该抗体以实现治疗剂对肿瘤的靶向治疗。另一种抗体基疗法 是通过提供本身对于其靶向的肿瘤/癌细胞具有治疗性能的抗体。该第二种形式的抗体基 疗法的附加优点是人们可以将另一种治疗剂结合至该治疗抗体以实现更有效的治疗。任何 抗体引导的疗法和特别是使用单克隆抗体（mAb)的疗法的主要优点是能够将增加剂量的 治疗剂输送至肿瘤，并且更多地使正常组织免受治疗剂的副作用。
[0008] 尽管识别了用于癌症疗法的几种抗体，但仍需要识别新的和更有效的疗法来克服 免疫耐受性和激活T细胞应答。另外，即使分子工程已经改善了这种抗体基疗法的前景，但 是仍存在关于生成的重组产品的连续性的问题。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了用于生成如下的新型和一致的合成方法：同源重组融合免疫调节分 子，更具体地，包括连接至免疫调节蛋白的靶向抗体的重组嵌合多肽。
[0010] 为了介导对癌症的免疫应答，T细胞活化和共刺激都是重要的。T细胞的共刺激主 要通过CD28与其在抗原呈细胞（APC)上的B7家族的配体结合来介导。然而，在活化之后， T细胞表达被称作细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的分子，其以比⑶28高的多的亲和 力结合至B7配体，并且这种结合下调了T细胞活性。因此，包括结合至CTLA-4受体的抗体 将阻断与B7家族的配体的相互作用并增强抗肿瘤应答。
[0011] 上面讨论的B7配体之一程序性死亡配体-I(PDLl)通过如下阻断了抗肿瘤免疫： (1)通过结合至其在T细胞上的受体HH(⑶279)而使肿瘤反应性T细胞耐受；（ii)通过经 肿瘤细胞表达的I3DLl的H)-l信号传导使得肿瘤细胞对于CD8+T细胞和FasL介导的裂解 是抗性的；和（iii)促进诱导的T调节细胞的生长和维持。因此，TOLl是自然抗肿瘤免疫 和需要活化宿主T细胞介导的抗肿瘤免疫的癌症免疫疗法的主要障碍。这一理念得到了如 下研究的支持，所述研究证明了TOLl-PDl相互作用的抗体阻断改进了T细胞活化并减小了 肿瘤进展。尽管TOLl或PDl的抗体已经在癌症患者的小团体中显示了疗效，但是大多数患 者没有受益于抗体治疗。因此，需要用于调节ro-Li功能的机制，其将产生新的普遍适用的 用于将癌症患者中的ro-Li介导的免疫抑制最小化的治疗且比当前可获得的ro-i或ro-Li 的mAb更有效。
[0012] 许多上皮癌如结肠、头颈部、乳房、卵巢、非小细胞肺（NSCL)和胰腺癌症的特征是 癌细胞表面上的表皮生长因子受体（EGFR)的水平不正常得高。表皮生长因子受体家族 (EGFR ;HER1，HER2/neu，HER3和HER4)包括具有内在酪氨酸激酶活性的细胞膜受体，所述细 胞膜受体响应不同配体的结合而诱发生物生理信号反应的级联。这些受体在恶性肿瘤细胞 在种种人肿瘤中的行为方面发挥关键作用，从而诱导增加的增殖、降低凋亡、并增强肿瘤细 胞能动性和血管形成。因此，本发明包括革G向EGFR家族成员的抗体。
[0013] 本发明还提供通过削弱癌细胞的免疫耐受性而降低癌细胞生长的方法，其中T细 胞仍是有活性的并抑制T调节的招募，所述T调节的招募被认为是抑制免疫系统的肿瘤应 答。因此，由本发明的多核苷酸序列产生的嵌合多肽因为表达的融合或嵌合多肽而有用于 治疗癌症。
[0014] 在一个方面，本发明提供如下的嵌合多肽，其包含至少一个靶向癌细胞的靶向部 分和至少一个削弱癌细胞的免疫耐受性的免疫调节部分，其中所述靶向部分和所述免疫调 节部分通过足够长度氨基酸残基的氨基酸间隔子连接，使得两个部分能够成功地结合至它 们各自的靶点。在可选方案中，靶向部分和削弱癌细胞的免疫耐受性的免疫调节部分可以 直接相互结合。本发明的嵌合/融合多肽有用于结合至癌细胞受体并降低癌细胞避免免疫 应答的能力。
[0015] 优选靶向部分是对CTLA-4或EGFRl具有结合亲和力的抗体，其中所述抗体是从如 下多核苷酸序列转录的，所述多核苷酸序列缺失用于表达所表达的抗体的重链的C末端赖 氨酸的核苷酸。已经发现，通过在转录期间去除抗体重链的C末端赖氨酸，终产品显示提高 的同源性，由此降低了进一步纯化的需要和成本。
[0016] 已知在IgG分子在CHO细胞中转录和翻译的过程期间，将表达在重链C末端的赖 氨酸（K)。在商业产品中，必须去除这种表达的赖氨酸以增加纯度。如在图1中所示，在制 造的产品存在很多异源性。这是因为CHO细胞具有内源酶羧肽酶B(CPB)而发生，只要表达 的抗体仍可细胞内获得，则所述羧肽酶B将会剪切C末端赖氨酸。然而，一旦抗体被分泌到 介质中，该酶将不会剪切赖氨酸。因此，该内源CPB的剪切效率是基于细胞内的可获得性。 这样，抗体中的一些将会分泌有赖氨酸而一些将不会，并且这种组合将在分泌的产品中造 成显著的异源性，即一些抗体有C末端赖氨酸而一些没有。当将重组产品用于治疗用途时， 人们需要纯化至同源性。因此，现有技术的重组产品需要另外的纯化步骤，其中重组产品需 要首先用酶CPB处理并使用另外的步骤再次纯化以从终产品去除任何赖氨酸和酶CPB。这 些另外的步骤向制造工艺添加了大量成本。
[0017] 通过从缺失用于表达所表达的抗体的重链的C末端赖氨酸的核苷酸的多核苷酸 序列转录表达的蛋白，本发明避免了以前的合成重组抗-CTLA-4和抗-EGFRl抗体的方法的 缺点。
[0018] 本发明是基于通过表达编码削弱或逆转癌细胞的免疫耐受性的融合蛋白的多核 苷酸而制备嵌合/融合蛋白。癌细胞能够通过在肿瘤微环境中的特定免疫抑制机制逃脱化 疗剂或肿瘤靶向抗体的消除并且癌细胞的这种能力被视作免疫耐受性。这种免疫抑制机制 包括免疫抑制细胞因子（例如转变生长因子P(TGF-P))和调节性T细胞和/或免疫抑制 髓样树突状细胞（DC)。通过削弱肿瘤诱导的免疫耐受性，本发明提供用于癌症治疗的有效 组合物和方法，其任选地与另一种现有的癌症治疗相结合。通过活化和利用对于抗性和弥 散性癌细胞的T细胞介导的适应性抗肿瘤，本发明提供削弱肿瘤诱导的免疫耐受性和增强 化疗的抗肿瘤疗效的策略。
[0019] 在另一个方面，本发明提供包含与至少一个免疫调节部分融合的至少一个靶向部 分的分子。所述靶向部分特异地结合靶分子，所述免疫调节部分特异地结合以下分子中的 一种：⑴转化生长因子0 (TGF-0 )和/或（ii)程序性死亡配体I(TO-Ll)。
[0020] 在另一个方面，靶向部分包括含有重链和轻链两者的抗体，其中抗体特异地结合 肿瘤细胞、肿瘤抗原、肿瘤血管、肿瘤微环境或肿瘤浸润免疫细胞的组分。值得注意的是，重 链和/或轻链可能单独地连接至相同类型的免疫调节部分或分开的和不同的免疫调节部 分。另外，抗体靶向部分的重或轻链可以连接至免疫调节部分，免疫调节部分转而可以进一 步连接至第二免疫调节部分，其中在两个免疫调节部分之间有连接子。
[0021] 在又一个方面，提供了包含肿瘤靶向部分和免疫调节部分的嵌合多肽，所述免疫 调节部分包含结合转化生长因子P(TGF-P)的分子，其中肿瘤靶向部分是结合EGFRl的抗 体，其中抗体可以是完整的抗体、重链或轻链。
[0022] 肿瘤靶向部分可包括靶向癌细胞的单克隆抗体，包括但不限于西妥昔单抗，曲妥 单抗，利妥昔单抗，易普利姆玛，tremelimumab，莫罗单抗-⑶3,阿昔单抗，达利珠单抗，巴利 昔单抗，帕利珠单抗，英夫利昔，吉妥珠单抗奥唑米星，阿仑单抗，替伊莫单抗，阿达木单抗， 奥马珠单抗、托西莫单抗，1-131托西莫单抗，依法利珠单抗，贝伐单抗，帕尼单抗，帕妥珠单 抗，那他珠单抗，依那西普，IGNlOl(Aphton)，volociximab(BiogenIdec和]3DLBioPharm)， 抗-CD80 单抗（BiogenIdec)，抗-CD23 单抗（BiogenIdel)，CAT-3888(Cambridge AntibodyTechnology),CDP-79I(ImcIone),eraptuzumab(Immunomedics), MDX-010(MedarexandBMS)，MDX-060 (Medarex)，MDX-070 (Medarex)，matuzumab(默克）， CP-675,206(Pfizer)，CAL(Roche)，SGN-30(SeattleGenetics)，zanolimumab(Serono和 Genmab)，adecatumumab(Sereno)，奥戈伏单抗（UnitedTherapeitics)，尼妥珠单抗（YM Bioscience)，ABT_874(AbbottLaboratories)，地诺单抗（Amgen)，AM108(Amgen)，AMG 714(Amgen)，fontolizumab(BiogenIdee和]3DLBioPharm)，达克珠单抗（BiogentIdee 和]3DLBioPharm)，戈利木单抗（Centocor和Schering-Plough)，CNTO1275 (Centocor)， ocrelizumab (Genetech 和 Roche)，HuMax_CD20 (Genmab)，贝利木单抗（HGS 和 GSK)，依 中白珠单抗（Immunomedics)，MLN1202 (Millennium Pharmaceuticals),visilizumab (PDL BioPharm)，塔西单抗（Roche)，ocrerlizumab (Roche)，聚乙二醇化赛妥珠单抗（UCB， 前 Celltech)，依库刚单抗（Alexion Pharmaceuticals)，培克珠单抗（Alexion Pharmaceuticals 和 Procter&Gamble)，阿昔单抗（Centocor)，ranibizimumab (Genetech)， 美泊利单抗（GSK)，TNX-355 (Tanox)，或MY0-029 (Wyeth)〇
[0023] 在优选实施方式中，肿瘤靶向部分是通过本发明的方法生产的结合至CTLA-4或 EGFRl的单克隆抗体，其中所述方法包含以下步骤：
[0024] a.制备编码融合蛋白的密码子优化的核酸序列，其中抗体的密码子优化的核酸序 列缺失用于表达在抗体重链C末端的赖氨酸的核苷酸；
[0025] b.在能够瞬时或连续表达的宿主细胞中克隆所述融合蛋白的优化序列；
[0026] c.在生长的合适条件下在介质中生长宿主细胞并允许宿主细胞表达融合蛋白； 以及
[0027] d?收集分泌的融合蛋白。
[0028] 在又一个方面，免疫调节部分包括结合TGF-P并抑制其功能的分子。具体地，免 疫调节部分包括转化生长因子-P受体TGF-PRII、TGF-PRIIb或TGF-PRIII的细胞外 配体-结合区域。在另一个方面，免疫调节部分包括TGF-PRII的细胞外配体-结合区域 (ECD)〇
[0029]在又一个方面，靶向部分包括特异地结合至HER2/neu、EGFRl、⑶20或细胞毒性T 淋巴细胞抗原-4 (CTLA-4)的抗体，其中免疫调节部分包括TGF-PRII的细胞外配体-结合 区域。
[0030] 在又一个方面，免疫调节部分包括特异地结合程序性死亡-1配体I(ro-Li)并抑 制程序性死亡-1配体1的活性的分子。
[0031] 在另一个方面，靶向部分包括特异地结合至册1?2/1161146?1?1、〇)20、细胞毒性1'淋 巴细胞抗原-4(CTLA-4)、CD25(lL-2a受体；IL-2aR)或CD4的抗体、抗体片段或多肽，其中 免疫调节部分包括程序性死亡-I(PD-I)的细胞外配体-结合区域或胞外域。
[0032] 在又一个方面，靶向部分包括特异地结合至EGFRl和CTLA-4的抗体，免疫调节部 分包括来自与转化生长因子(TGF-P)相互作用的序列。
[0033] 在一个方面，本发明提供用于编码融合多肽的优化基因，所述融合多肽包含至少 一个靶向部分和至少一个免疫调节部分，用于治疗人类受试者中的癌症，其中已经对所述 基因进行了优化以增加在人类受试者和/或细胞中的表达。
[0034] 在另一个方面，本发明提供包含用于治疗人类受试者中的癌症的优化基因的载 体，其中所述优化基因已经被修饰为增加了CG序列。优选地，载体包括用于编码至少一个 靶向部分、至少一个免疫调节部分和连接部分的核苷酸序列，其中如在表2中所列出的，优 化的核苷酸序列选自SEQIDNO: 1-7。
[0035] 在又一个方面，本发明提供治疗受试者中癌症的方法，所述方法包含：
[0036]提供至少一种包含如下核苷酸序列的重组载体，所述核苷酸序列编码至少一个靶 向部分、至少一个免疫调节部分和位于靶向部分和免疫调节部分之间的连接部分，其中所 述核苷酸序列选自SEQIDNO: 1-7 ;和
[0037] 在使得所述核苷酸序列以在受试者中生产治疗有效量的编码的融合蛋白的水平 表达的条件下将所述重组载体施用至受试者。
[0038] 在又一个方面，本发明提供用本发明的编码融合蛋白肽的多核苷酸序列转染的重 组宿主细胞，其中所述多核苷酸序列选自SEQIDNO:1_7。
[0039] 在又一个方面，本发明构想了制备本发明的嵌合融合蛋白的方法，其包含：
[0040] 用编码嵌合融合蛋白的多核苷酸序列转染宿主细胞以制造转化的宿主细胞，其中 所述多核苷酸序列编码至少一个靶向部分和至少一个免疫调节部分，其中所述多核苷酸序 列包含选自SEQIDNO: 1-7的序列的组合；和
[0041] 将所述转化的宿主细胞保持在足以表达所述嵌合融合蛋白的生物条件下。
[0042] 在另一个方面，本发明涉及嵌合融合蛋白的用途，其中在用于治疗癌症的药物中 时，如分别在图3、4和5中所示的，所述嵌合融合蛋白包含抗-EGFRl连接子H)1(SEQIDNO: 8、9、1〇和11);抗46卩1?1-连接子-16卩01?11(5￡〇1〇勵 ：8、9、1〇和12);抗-(：1'1^-4-连接 子-PDUSEQIDNO:13、14、10和11)。优选地，融合蛋白在宿主细胞中表达，并且以治疗量 施用这种表达的蛋白以在需要其的受试者中减小癌症的影响。
[0043] 在又一个方面，本发明提供治疗肿瘤病的方法。在各个方面，该方法包括将本发明 的一种或多种融合蛋白施用至需要其的受试者，将本发明的一种或多种融合蛋白连同另一 种抗癌疗法施用至受试者。在一个方面，所述抗癌疗法包括化疗分子、抗体、小分子激酶抑 制剂、激素制剂或细胞毒素剂。所述抗癌疗法可还包括电离放射、紫外线放射、冷冻消融、热 消融或射频消融。
[0044] 在优选的实施方式中，治疗活性抗体-肽融合蛋白是融合至一个或多个削弱癌细 胞的免疫耐受性的免疫调节部分的