新型连接酶活性的制作方法
【专利说明】新型连接酶活性
[0001] 发明背景
[0002] 通过互补RNA夹持的单链（ss)DNA寡核苷酸的连接是技术如RNA介导的退火、选择 和连接（RASL)中的关键步骤。T4DNA连接酶已经用于RASL以及其它RNA分析和检测技术如 分子倒置探针、改良的连接酶链反应和连接酶检测反应（例如，Yeakley, et al.，Nat Biot echnol. , 20(4):353-8(2002), Bullard and Bowater, Biochem. J. , 398 (I):135-44 (2006)； Li, et al.，Curr Protoc Mol Biol. Apr !Chapter 4:Unit 4.13.1-9(2012);美 国公开申请号 2011/0092375、美国专利号 7,361，488 ;Nilsson，et al.，Nature Biotechnology, 18:71 (2000) ；Nilsson,et al. , Science, 265, 2085-2088 (1994)； Barany1PCR Methods Appl. , 1:5-16(1991) ；Landegren, Bioessays, 15:761-765(1993)； ffiedmann, et al. ,PCR Methods Appl. ,3 : S51-64(1994) ；Nilsson,et al. , Nat Genet. , 16:252-255 (1997) ；Baner,et al. ,Nucleic Acids Res. , 26:5073-5078 (1993)； Hardenbol,et al., Nature Biotechnol.,21:673-678 (2003);以及 Landegren, Methods Cell Biol. , 75:787-797(2004))) 〇
[0003] T4DNA连接酶不佳地需要例如长温育时间、高浓度的连接酶和低ATP浓度来发挥 作用，以克服腺苷酸化DNA副产物的优先形成从而完成连接。
[0004] T4RNA连接酶作为连接与RNA模板或夹板（splint)杂交的DNA链的替代选择被测 试（美国专利号6, 368, 801)。据报道，来自迀徙蚱M (Melanoplus sanguinipes)昆虫痘病 毒的NAD+依赖性连接酶对与RNA杂交的DNA具有类似于T4DNA连接酶的连接活性，但仅在 Mn 2+存在的情况下具有（Lu, et al.，Biocimica et Biophysica Acta, 1701:37-48 (2004))。 Sriskanda, et al.，Nucleic Acid Research, 26 (15) :3536-3541 (1998)报道了来自绿草 履虫（Paramecium bursaria)小球藻病毒的PBCV-1DNA连接酶，其中实验数据显示该连接 酶可在DNA模板或DNA夹板上连接寡核苷酸，但不能在RNA模板或RNA夹板上连接寡核苷 酸。这些结果通过晶体结构研究进行解释，其中作者显示PBCV-I连接酶迫使底物进入带切 口的底物一侧上的RNA类A型螺旋，但需要在切口的一侧上的DNA类B型螺旋提供5'磷酸 (Ho, et al. , J. Virol. , 71 (3) : 1931 (1997) ；Sriskanda, et al. , (1998) ；Nair, et al. , Nat. Struct. Mol. Biol. , 14:770-778 (2007))。相似的结果报道于 NAD 依赖性大肠杆菌（E. coli) DNA 连接酶（Nandakumar, Mol. Cell, 26:257-271 (2007))和人 DNA 连接酶 I (Pascal, et al.，Nature, 432:473-478 (2004))的晶体结构中，导致得出这些连接酶不能接受RNA夹持 的DNA作为连接底物的结论。
[0005] 发明概沐
[0006] 总体上，在一方面，提供组合物，其包含在缓冲液中的RNA夹板（splint)连接酶和 至少一种具有至少8个核苷酸长度的多核苷酸。一方面，RNA夹板连接酶是热稳定的。另 一方面，RNA夹板连接酶被固定在珠上。另一方面，夹板连接酶为PBCV-I连接酶。
[0007] 组合物的实施方式可包括下列特征的一个或多个：RNA夹板连接酶和至少一种多 核苷酸具有连接酶比多核苷酸为大于100:1或小于100:1、10:1或1:1的摩尔比；缓冲液包 含 I yM-1. 5mM 的 ATP。
[0008]总体上，在一方面，提供连接两种多核苷酸片段的方法，多核苷酸片段为单链或具 有单链区域或者为双链但适于变性，该方法包括：将至少两种多核苷酸片段如具有与RNA 夹板互补的区域的DNA多核苷酸片段与RNA夹板连接酶组合；和允许这两种多核苷酸连接 以形成单一多核苷酸。另一方面，多核苷酸片段是DNA片段，该DNA片段是复杂混合物的一 部分，而RNA夹板具有预定的序列。可选地，DNA片段具有确定的序列，而RNA夹板是RNAs 复杂混合物的一部分。
[0009] 方法的实施方式可包括以下特征中的一个或多个：在含有至少I yM-1. 5mM ATP 缓冲液中进行连接反应；利用具有大于8个核苷酸长度的RNA夹板和各自具有大于8个核 苷酸长度的多个多核苷酸，温育反应少于6个小时，以实现至少70% -90 %的多核苷酸连 接；温育反应少于1个小时，以实现至少70% -90%的多核苷酸连接；和/或以大于100:1 或小于100:1、10:1或1:1的酶：底物摩尔比进行连接反应。在某些实施方式中，在相似条 件下，RNA夹板连接酶的连接可比使用T4DNA连接酶的连接更迅速地发生；单链多核苷酸可 以是用于定量PCR的模板，以使得所连接的单链多核苷酸的扩增产生比当用T4DNA连接酶 替换RNA夹板连接酶时所观察到的更少的非模板多核苷酸背景扩增，和/或夹板连接酶能 够在相同的反应条件下和使用相同的多核苷酸以比T4DNA连接酶快至少5倍或10倍的速 率连接多核苷酸。
[0010] 总体上，另一方面，提供分析mRNA的剪接历史的方法，包括：通过将ssDNA寡核苷 酸与mRNA和RNA夹板连接酶组合，确认剪接点、剪接变体或剪接点处的突变。
[0011] 总体上，另一方面，提供检测RNA序列的方法，包括：使具有在连接点与夹板RNA互 补的区域的多核苷酸退火；使用RNA夹板连接酶连接多核苷酸、扩增连接产物；和检测和任 选地定量扩增产物。
[0012] 方法的实施方式可包括以下特征的一个或多个：RNA序列是微小RNA;和/或RNA 夹板连接酶是PBCV-I连接酶。
【附图说明】
[0013] 图1概述了对由DNA或RNA模板夹持的DNA连接的测定。预退火的带切口的底物 如20脱氧核苷酸受体DNA、30脱氧核苷酸、FAM标记的和5'磷酸化的供体DNA以及DNA或 RNA反向互补序列（夹板），与合适的连接酶温育，然后用IOOmM EDTA淬灭并用甲酰胺变性。 可分离片段，并且通过毛细管电泳检测FAM标记的ssDNA连接产物。
[0014] 图2 (A)-2 (D)显示由DNA或RNA夹持的两种DNA寡核苷酸的连接（DNA-DNA连接）。 明显的峰是通过与可靠的标准品共洗脱确认的未反应的PDNA(I)和连接产物（II)。IOOnM 的标准寡核苷酸与IOOnM PBCV-1DNA连接酶（2(B)和2(D))或IOOnM T4DNA连接酶（2(A) 和2(C))在20°C下反应30分钟。
[0015] 组2(A)和2 (B):两个DNA寡核苷酸与DNA2(A)和2 (B)杂交，在此峰对应于完全 连接。
[0016] 组2 (C)和2 (D):两个DNA寡核苷酸与RNA反向互补序列杂交。只在使用PBCV-I 连接酶2 (D)的反应中观察到对应于完全连接的峰，而使用T4DNA连接酶2 (C)没有观察到 连接。
[0017] 图3 (A) -3 (B)显示使用一系列浓度（lpM-10 yM)的T4DNA连接酶、T4RNA连接酶 1或PBCV连接酶，在20°C下在含有ImMATP的标准连接缓冲液中连接IOOnM预退火的、由 DNA夹持的标准寡核苷酸底物。
[0018] 3(A)DNA-DNA:由 DNA夹持的连接。
[0019] 3 (B)DNA-DNA :由RNA反向互补序列夹持的连接。
[0020] PBCV-1DNA连接酶和T4DNA连接酶均可以相似连接活性连接由DNA夹持的DNA寡 核苷酸，但只有PBCV-I连接酶可针对由RNA反向互补序列夹持的寡核苷酸底物形成可检测 量的连接产物。T4RNA连接酶1对DNA夹持的连接具有轻微的活性，对RNA夹持的连接没有 可检测的活性。
[0021] 图4 (A)-4 (B)显示在20°C下在含有ImM ATP或IOy M ATP和IOOnM预退火的带切 口的底物的标准连接缓冲液中，使用一系列浓度（lpM-10 y M)的T4DNA连接酶和PBCV-I连 接酶连接相同的由RNA反向互补序列夹持的寡核苷酸底物。
[0022] 4 (A):在ImM ATP存在的情况下由RNA反向互补序列夹持的DNA-DNA连接。
[0023] 4 (B):在10yMATP存在的情况下由RNA反向互补序列夹持的DNA-DNA连接。
[0024] 在含有ImMATP或10yMATP的缓冲液中，PBCV-I连接酶以相似的连接活性连接 由RNA夹持的DNA寡核苷酸。T4DNA连接酶仅在10yMATP下具有提高的活性，但在相同的 条件下，该活性比PBCV-I连接酶的活性至少小5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。PBCV-I 连接酶可在含有高ATP浓度的缓冲液中连接可检测量的由RNA反向互补序列夹持的寡核苷 酸底物，而T4DNA连接酶不可以。
[0025] 图5显示在多种温度下PBCV-I连接酶RNA夹持的DNA连接活性。在16°C、25°C和 37°C下进行由两种不同RNA模板夹持的DNA-DNA连接。第一种DNA寡核苷酸及其反向互补 序列是图9中所述的标准模板（正方形），还使用了具有Sriskanda, et al.，（1998)中所 述的序列（圆形）的第二种模板，其显示序列对连接的作用很小或没有作用。反应条件是 I yM PBCV-I连接酶、250nM RNA夹持的寡核苷酸底物在标准连接酶缓冲液中温育30分钟。
[0026] 图6显示使用RNA夹板连接酶的qPCR检测的RASL测定设计。DNA探针被设计为 具有与RNA靶标互补的区域和