一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物农药领域，特别是一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体及其制 备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 来源于苏云金芽孢杆菌Bt)的Bt毒素蛋白是目 前最为有效的抗虫资源，但经报道的新高效株系越来越少（Bravoetal.，2013;Bravo etal.，2011)而Bt毒素使用量增加使其在害虫抗药性及次生害虫上升等方面存在生态 风险，这一现状促使高特异活性和新功能类的Bt毒素抗虫资源的积极开发（Bravoand Soberon，2008;Pigottetal.，2008)。因此，模拟Bt毒素杀虫蛋白的筛选，开发其它类 型的杀虫蛋白，尤其是安全性更高的蛋白资源，是解决这些问题的有效途径之一。
[0003] 独特型抗体（Anti-idiotypicantibody,Anti-Id)理论以及人源化的抗体库筛 选技术可以获得具有模拟特定抗原（BtCry毒素）结构及功能的肽活性材料，目前所公开 的模拟的BtCry毒素包括：CrylAb(公开号为CN103773774A的中国专利)、Cry1B(公开号 为CN103773775A的中国专利)、Cry1C(公开号为CN103773776A的中国专利)、Cry2A(公 开号为CN104498501A的中国专利)，经过测鉴定，这些人源化的Cry毒素Anti-Id都具有 一定的杀虫活性，由此可见，抗独特型抗体制备技术是开发新型杀虫蛋白的一个新途径。
[0004] 抗体分子可以分为轻链（lightchain)和重链（heavychain)两部分，而轻链 和重链又分别可以分为可变区（variableregion,V区）和恒定区（constantregion,C 区)。抗体分子的恒定区是决定抗体分子结构中免疫原性的部位，而抗体的可变区则决定 了抗体分子的特异性。轻链可变区（lightchainvariable，VL)或者重链可变区（heavy chainvariable，VH)都是由4个骨架区（frameworkregion，FR)和3个互补决定区 (complementaritydeterminingregion，Q)R)交替排布连接而成。抗体V区的⑶R是抗 体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性(周光炎，2007)。将人源单链抗体的CDR 移植至其他动物来源抗体可变区，替代其他动物来源抗体CDR，使其他动物来源抗体获得人 源单链抗体的抗原结合特异性，扩展杀虫蛋白基因资源的来源谱系，类似的这种技术手段 在医学研究上已见报道（Jones,etal.，1986;Irieetal.，1989;Sompurametal.， 1996;Wuetal.，1999;Hamannetal.，2002)，这种改型抗体（reshapedantibody)，也 称CDR植入抗体（CDRgraftingantibody)，比嵌合抗体（chimericantibody)更进了一步。
[0005] CrylAb毒素抗独特型单链抗体由于可模拟Cry毒素并与其竞争受体蛋白，将杀虫 效果较好的抗独特型单链抗体CDR区取代到其他动物来源的单链抗体上相应的CDR区，穿 插在各种来源抗体的8个FR之间，S卩在动物源抗体的基础上将动物源抗体CDR区基因替 换为人源抗体CDR区基因，可快速获得多种动物来源的改型抗体，获得多种动物来源的杀 虫蛋白资源，使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能 性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向，目前，上述抗虫基因分子改造的方法未见 公开报道。
【发明内容】
[0006] 为实现开拓多种动物来源的杀虫蛋白资源之目的，本发明提供一种具有杀 虫活性的牛源化改型抗体及其制备方法与应用，该牛源改型抗体对小菜蛾 具有较高的杀虫活性，本发明是这样实现的： 一种具有杀虫活性的牛源化改型抗体，其核苷酸序列如SEQIDN0. 5所示，氨基酸序列 如SEQIDN0. 4 所示。
[0007] -种具有杀虫活性的牛源化改型抗体的制备方法，具体步骤如下： (a) 由GenBank筛选牛源抗体，并分别对其VH和VL进行氨基酸序列比对分析，确定保 守序列，再根据頂GT鉴定方法分别确定VH和VL的FR1、FR2、FR3和FR4 ; 其中，VH和VL序列分别如SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示； (b) 将人源化抗独特型单链抗体A12的6个⑶R植入牛源抗体的相对应部分，再加上连 接重、轻链的（GGGGS)3Linker，即获得牛源抗体，其氨基酸序列如SEQIDNo. 4所示； 反向翻译所述牛源抗体氨基酸序列，并且在获得的核苷酸序列两端加上NcoI、NotI酶切位点及对应的碱基保护核酸序列，最终获得的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示；将核苷 酸序列SEQIDNo. 5连接载体pUC57上，获得合成质粒bovine-A12-pUC57。
[0008] (c)利用NcoI、NotI对合成质粒bovine-A12-pUC57进行双酶切，回收目的片 段，利用T4DNA连接酶将回收的目片段接到pIT2载体上，次日将连接产物转入TG1化学转 化感受态细胞中，然后将转化菌涂布于TYE-AG平板，37°C培养过夜；次日随机挑取单克隆 菌落至lmL2XTY-A培养基中，于37。C，250rpm摇床过夜培养，获得bovine-A12-pIT2菌 液； (d)以SEQIDNo. 6和SEQIDNo. 7为引物，以bovine-A12-pIT2菌液为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，所获得的920bp的单一条带，即为所述牛源化改型抗体。
[0009] 进一步，本发明所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体的制备方法，步骤（d)所述 PCR扩增是指： PCR扩增体系为：2XPCRPremix10yl、10yM的引物各lyl、bovine-A12-pIT2菌 液2yl、ddH20补足至20yl; PCR扩增条件：94°C5min;94°C45s，56°C45s，72°C1min，共 30 个循环；72 °C延伸10min，4 °C保持； 一种如本发明所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体核苷酸序列的原核载体。
[0010] -种如本发明所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体在农业虫害防治中的应用。
[0011] -种如本发明所述具有杀虫活性的牛源化改型抗体的基因材料。
[0012] 本发明通过生物信息学预测牛源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特 型单链抗体A12的6个CDR来确定牛源化改型抗体的列，进行人工合成，从而构建A12的牛 源化的改型抗体b〇vine-A12-pUC57,并通过更换易于噬菌体表达的pIT2载体，获得与小菜 蛾中肠BBMV具有结合活性的牛源化改型抗体b〇vine-A12-pIT2,与现有技术相比，本发明 的有益效果在于： (1)本发明利用生物信息学预测和人工合成的方法可快速高效的获得动物来源的改型 抗体，获得多种动物来源的杀虫蛋白资源，使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安 全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向。
[0013] (2)本发明获得的牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2可变区的FR属于牛源，而CDR 属于人源，也可称为人-牛嵌合抗体，因此将bovine-A12-pIT2应用于农业虫害防治时，对 人体危害小。
[0014] (3)牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2与昆虫BBMV的亲和力同人源化抗体A12相 当，也可替代CrylAb毒素用于生物防治，以防治害虫逐年增加的抗药性。
【附图说明】
[0015] 图1为牛源抗体的VH结构。
[0016] 图2为牛源抗体的VL结构。
[0017] 图3是CrylAb毒素抗独特型单链抗体A12的氨基酸序列结构示意图。
[0018] 图4是合成的b〇vine-A12-pUC57质粒图谱；其中合成的基因部分长度733bp，连 接到PUC57载体而构成bovine-A12-pUC57质粒。
[0019] 图5是Ncol、NotI对bovine-A12-pUC57质粒双酶切的电泳图；其中，1、2为Nco I、NotI双酶切后的图谱，714&口为切下的目的片段；3为完整的13〇"11641211^57质粒 图谱；M为5000bp的DNAladder。
[0020] 图6是pIT2载体图谱，其中包含NcoI、NotI酶切位点。
[0021] 图7是牛源化改型抗体bovine-A12-pIT2同小菜蛾BBMV结合的ELISA鉴定分析， 其中A12为人源化抗体，CK-为阴性对照D5, 表示经单因素方差分析后数据间差异显 著（/<0? 01)。
【具体实施方式】
[0022] 为方便理解本发明所述技术方案，以下结合附图和具体实施例做进一步阐述，下 列实施例仅用于说明而非是对本发明权利要求范围的限制；下述实施例中所述实验