用于治疗恶性肿瘤的嵌合抗原受体及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物与医药技术领域，涉及一种用于治疗恶性肿瘤的嵌合抗原受体及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 嵌合抗原受体（chimericantigenreceptor,CAR)修饰的T细胞（CAR-T)是将识 别肿瘤相关抗原的单链抗体与T细胞活化基序相结合，通过工程修饰赋予T细胞更强的肿 瘤靶向性及杀伤活性。
[0003] 自1989年，由Eshhar及其同事首次提出CAR概念以来，已经经历了三个不同的 发展阶段。第一代CAR受体，包含胞外特异性识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由 CD3G或FceRIy的"免疫受体酪氨酸活化基序"ITAM(immunoreceptortyrosine-based activationmotifs)信号链进行传递。
[0004] "免疫受体酪氨酸活化基序"ITAM(immunoreceptortyrosine-basedactivation motifs)是指免疫细胞活化相关受体（例如TCR/CD3、FcRy等）胞浆区所共有的以酪氨酸 基序（tyrosine，Y)为基础的氨基酸序列基序，被磷酸化后能够与信号转导途径下游的信 号分子结合，导致细胞活化。
[0005] 由于CAR-T细胞所识别的是肿瘤细胞表面的抗原，而非与MHC分子结合形成 MHC-抗原复合物从而被提呈到细胞表面的抗原，因而可绕过T细胞的MHC分子限制性。而 且，CAR-T技术通常将T细胞的第一信号与第二信号偶联到同一分子结构中，使CAR-T细胞 具有更强的自主性，基本无需其他类型免疫细胞的辅助即可发挥治疗作用。
[0006] 但第一代CAR受体由于缺乏T细胞活化所需的共刺激信号，导致T细胞在体内存 活时间较短，细胞因子分泌少，只能发挥瞬间活化效应。第二代CAR受体通过增加了一个共 刺激信号分子的胞内结构域（例如CD28分子结构域），提供了T细胞活化的两种信号，增强 了T细胞的增殖能力及细胞因子（例如IL-2、IFN-y及GM-CSF)的分泌能力，从而突破了 肿瘤微环境的免疫抑制。第三代CAR受体在第二代CAR的基础上，新增加了另外一种共刺 激信号分子的胞内结构域，进而具有了更好的效应功能以及更长的体内存活时间。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种用于治疗恶性肿瘤的嵌合抗原受体及其制备方法与应 用。
[0008] 本发明所提供的用于治疗恶性肿瘤的嵌合抗原受体是在第三代CAR受体技术的 基础上研制获得的，具体为NY-ES0-1特异性嵌合抗原受体，从结构组成角度讲，所述嵌合 抗原受体为自氨基端到羧基端依次由NY-ES〇-lTCRa链的可变区、NY-ES0-1TCRP链的可 变区、CD8的铰链区和跨膜区、CD28胞内信号结构域、CD137胞内信号结构域、CD3G胞内信 号结构域组成的蛋白质。
[0009] 其中，所述NY-ES〇-lTCRa链的可变区的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述 NY-ES0-1TCRP链的可变区的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述CDS的铰链区和跨 膜区的氨基酸序列如序列表中序列11所示；所述CD28胞内信号结构域的氨基酸序列如序 列表中序列12所示；所述CD137胞内信号结构域的氨基酸序列如序列表中序列13所示；所 述CD3G胞内信号结构域的氨基酸序列如序列表中序列14所示。
[0010] 进一步，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中序列8所示。
[0011] 在本发明中，所述嵌合抗原受体具体为将重组慢病毒表达载体PLVX-NY-ES0-1TCR -⑶8-⑶28-⑶137-⑶3G导入细胞后表达得到的含有序列表中序列8所示氨基酸序列的蛋 白质；所述重组慢病毒表达载体PLVX-NY-ES0-1TCR-⑶8-⑶28-⑶137-⑶3G为将慢病毒表 达载体pLVX-IRES-ZsGreenl的酶切位点Xhol和BamHI之间的小片段替换为序列表中序列 1所示DNA片段后得到的重组质粒。
[0012] 编码所述嵌合抗原受体的基因也属于本发明的保护范围。
[0013] 其中，编码所述NY-ES〇-lTCRa链的可变区的基因的核苷酸序列如序列表中序列 2所示；编码所述NY-ES0-1TCRP链的可变区的基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示； 编码所述CD8的铰链区和跨膜区的基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示；编码所述 CD28胞内信号结构域的基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示；编码所述CD137胞内信 号结构域的基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示；编码所述CD3G胞内信号结构域的 基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示。
[0014] 具体的，编码所述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示。其 中，序列1的第1-279位编码所述NY-ES0-1TCRa链的可变区，第280-501位编码所述 NY-ES0-1TCRI3链的可变区，第502-699位编码所述CD8的铰链区和跨膜区，第700-822 位编码所述CD28胞内信号结构域，第823-948位编码所述CD137胞内信号结构域，第 949-1287位编码所述CD3G胞内信号结构域。
[0015] 含有编码所述嵌合抗原受体的基因（序列1)的重组载体、表达盒、重组病毒或重 组细胞也属于本发明的保护范围。
[0016] 在本发明中，所述重组载体为能够表达所述嵌合抗原受体的重组慢病毒表达载 体。具体为将慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl的酶切位点Xhol和BamHI之间的小片 段替换为序列表中序列1所示DNA片段后得到的重组质粒（命名为pLVX-NY-ESO-lTCR-⑶ 8-CD28-CD137-CD3G)〇
[0017] 其中，所述重组细胞为能够表达所述嵌合抗原受体的免疫效应细胞；所述重组病 毒为能够表达所述嵌合抗原受体，且能够侵染免疫效应细胞的病毒。
[0018] 具体的，所述免疫效应细胞可为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、NK细胞或辅助性 T细胞；所述病毒可为慢病毒、疱疹病毒、巨噬细胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎 病毒或艾滋病毒。
[0019] 本发明还提供了一种NY-ES0-1特异性CAR-T细胞的制备方法。
[0020] 本发明所提供的NY-ES0-1特异性CAR-T细胞的制备方法，具体包括在T细胞上表 达所述嵌合抗原受体的步骤。
[0021] 进一步，所述"在T细胞上表达所述嵌合抗原受体"是通过如下实现的：用重组表 达载体A转染T细胞，从转染后的细胞中获得表达所述嵌合抗原受体的T细胞（CTL细胞）， 即为所述NY-ES0-1特异性CAR-T细胞（所述NY-ES0-1特异性CAR-CTL细胞）；所述重组 表达载体A为将慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreenl的酶切位点Xhol和BamHI之间的小 片段替换为序列表中序列1所示DNA片段后得到的重组质粒。
[0022] 其中，所述T细胞的来源可以来自包括外周血单个核细胞、腹水、胸腔积液或肿瘤 组织。
[0023] 前文所述的嵌合抗原受体或基因或重组载体或表达盒或重组病毒或重组细胞在 如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0024] (a)制备用于治疗治疗恶性肿瘤的产品；
[0025] (b)制备用于杀伤表达NY-ES0-1抗原肽的肿瘤细胞的产品；
[0026] (c)制备用于杀伤负载了NY-ES0-1抗原肽的HLA_A2+T2细胞株的产品。
[0027] 其中，所述恶性肿瘤为表达所述NY-ES0-1抗原肽的恶性肿瘤；具体的，所述恶性 肿瘤可选自如下中任一：原发性结肠癌、胰腺癌、胆管癌、胃癌、食道癌、腺癌、肺癌、乳腺癌 和泌尿系统的肿瘤。所述NY-ES0-1抗原肽的氨基酸序列如序列表中序列15所示。
[0028] 更加具体的，所述负载了NY-ES0-1抗原肽的HLA-A2+T2细胞株是将HLA-A2+T2空 载细胞株的培养液中加入终浓度为50yg/ml的所述NY-ES0-1抗原肽后，于37°C、5%C02 条件下孵育120min实现负载的。
[0029] 实验证明，本发明利用NY-ES0-1抗原肽制备的CAR-CTL细胞具有更强的肿瘤细胞 靶向性及杀伤活性，因而具有广阔的临床应用前景。
【附图说明】
[0030] 图 1 为鼠抗人CD3-PerCP\CD4-FITC\CD8-APC\NY-ES0-lTCR-PE抗体鉴定 CARNYES。1TeR遗传修饰的CTL细胞的流式细胞检测结果。其中，⑶3 +⑶8+⑶4的细胞即为CTL 细胞。
[0031] 图2为CARNYES。1TCR遗传修饰的CTL细胞的体外杀伤作用测定结果。其中，A的靶 细胞为负载了肿瘤抗原肽NY-ES0-1的HLA-A2+T2细胞株；B的靶细胞为HLA-A2+T2空载细 胞株。A和B中，CAR-T表示"实施例2获得的经CARNYES。1TeR遗传修饰的CTL细胞";CTL表 示"未修饰的CTL细胞"。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] HLA-A2+T2 空载细胞株：ATCC，ATCC编号为 ">\TCC?CR